甘肃祁连山国家级自然保护区岩羊肠道微生物的季节变化

刘家林,熊 欢,田春英,马 琴,邓 静,游章强*

(1.绵阳师范学院生态安全与保护四川省重点实验室，四川绵阳 621006；2.甘肃祁连山国家级自然保护区，甘肃张掖 734000)

0 引言

岩羊(Pseudoisnayaur)又名青羊，石羊，崖羊和蓝羊，属于偶蹄目(Artiodactyla)，牛科(Bovidae)，岩羊属(Pseudois).岩羊体背浅灰色，腹部及臀部为白色，雄性头部长有大型的角，长达60 cm，两角的基部比较靠近，仅有一条缝隙，雌性角短[1]，雄性体型稍微比雌性大[2].雄性岩羊全身毛色大致为青灰色，四肢外侧的毛呈现为黑色，背上有一条暗色中线，耳内侧、上下唇、颌及两侧颜色为灰白色；雌性岩羊的毛色较浅，岩羊幼仔的毛色随着年龄的增长加深[3]，岩羊主要食禾本科莎草科和蔷薇科植物[4].岩羊主要分布于青藏高原及其周围相邻的山域[5]，是雪豹(Pantherauncia)、狼(Canislupus)、红狐(Vulpesvulpes)和棕熊(Ursusarctos)等大型食肉动物的捕食对象[6].关于岩羊的研究目前主要集中在生境选择、种群生态学、行为生态学和种群遗传学等领域[1]，遗传和圈养种群肠道菌群研究等[7-8]，关于祁连山岩羊种群肠道菌群落的研究未见报道.岩羊是重要的经济物种，由于其数量多，分布较广泛，受人类活动及生境破碎化的影响[9]，近年来种群数量逐年下降，现已被国家重点保护野生动物名录列为Ⅱ级保护动物[10].哺乳动物肠道菌群主要有变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)及厚壁菌门(Firmicutes)等6大门类[11]，这些微生物与宿主互利共生、相互影响、相互作用，与宿主一同构成了复杂的肠道菌类生态系统[12].大量研究表明，肠道菌群与动物的免疫调控，物质代谢，营养吸收等生理活动有关.穆洋等[13]的研究表明，通过对鸡的肠道微生物的调节能提高鸡的血清免疫球蛋白等免疫物质，可以增强鸡的免疫力；在物质代谢方面，薄亭贝等[14]的研究表明，通过对布氏田鼠肠道微生物结构和功能的分析，发现肠道菌群通过cAMP-PKA-pCREB信号通路影响宿主进行能量调节和产热；在营养吸收方面，张亚南等[15]的研究表明，肠道微菌群通过肠-脑轴传导系统，将饱感转递给中枢系统从而调控食欲.

本研究通过无损伤取样法和16S rRNA扩增子测序分析法，对甘肃省祁连山国家级自然保护区内岩羊肠道微生物组成和多样性的季节差异进行了比较分析，通过研究分析岩羊肠道菌群，弥补了甘肃省祁连山野生岩羊的肠道微生物研究空白，为岩羊的管理与保护提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 样本采集信息

根据该区域的气候和植被类型特征，本研究将采样时间分别定义为草青季(2019年5月上旬)和草枯季(2018年10月上旬).采样期间，沿保护区日常巡护路线步行寻找岩羊粪样，发现新鲜粪样后，采集人戴上一次性手套，采集粪样堆里中间颗粒装入实验室已灭菌过后的15 mL离心管进行密封保存，每个粪堆只采集一个样本，并记录每次采样粪堆的GPS位点，并及时将粪样置于液氮中保存.本次实验分别在草青季和草枯季各采取了15个样本，并选择保存较好的各10个，用干冰盒快递运送至上海美吉生物有限公司进行测序.

1.2 粪便16S rDNA测序及分析流程

采用DNA提取试剂盒(上海美吉生物医药科技有限公司)提取样本总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA，于-20 ℃保存.以提取的总DNA为模板，采用16S rDNA V3-V4区引物：338F(5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3＇)，806R(5＇-GCACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇)进行PCR扩增(上海美吉生物医药科技有限公司).PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，13个循环，最后72 ℃延伸10 min.采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测初步定量，使用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，构建高通量测序文库，IlluminaMiseq上机测序.

1.3 数据分析

样品经Illumina MiSeq进行双端测序获得的原始序列经除去接头序列后的原始数据导入QIIME2[16](version 2020.2)进行一系列的分析.利用DADA2[17]Divisive amplicon denoising algorithm(via q2-dada2)对原始测序序列进行过滤、质控、除去嵌合体、合并双端序列、去噪为扩增序列变体Amplicon sequence variant (ASV).采用Feature-classifier[18](via q2-feature-classifier)中classify-sklearn基于Naïve Bayes方法以Silva(version 138 https://www.arb-silva.de/)数据库为参考对一系列的扩增序列变体进行物种注释，获得ASV在分类水平：门(Phylum)，纲(Class)，目(Order)，科(Family)，属(Genus)的注释信息.

在门和属级水平上，统计样品的物种丰度和多样性.使用QIIME2进行多样性分析，其中α多样性分析(包括Shannon指数、Simpson指数、ACE指数、Chao1指数和Coverage指数)，Chao1指数和ACE指数计算菌群丰富度，Shannon指数和Simpson指数计算菌群多样性，Coverage指数是指各样品文库的覆盖率.β多样性分析对ASV特征表进行主坐标分析(Principle coordination analysis，PCoA)，研究不同组间或样品间的菌群相似性和分类学差异性.采用Kolmogorov-Smirnov检验法对两组样本相对丰度数据分布型进行检验，利用独立样本t检验，检验肠道菌群组成和多样性的季节差异.利用LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size 线性判别分析)[19]分析岩羊肠道群落的差异性物种.

2 结果与分析

2.1 测序数据统计

基于Illumina MiSeq测序平台对细菌16S rRNA基于V3～V4片段测序分析，20份样品测得1 302 393条有效序列，经过对原始测序序列进行过滤、质控并除去嵌合体后得到224 910条序列，序列平均长度463.04 bp，共获得5 813个扩增序列变体(ASV).将所获得的ASV与数据库(Silva 138)进行注释分析，在20个岩羊粪便中，检测到的微生物共属于17个门、34个纲、81个目、132个科、204个属.通过绘制稀释曲线来评判测序数据是否足以反映样本种的物种多样性(图1).随着测序深度的不断增加，曲线趋向平缓，表明测序深度能够覆盖样品中的绝大多数物种，能够反映所有样品的细菌群落结构和多样性.本次测序，所有样品的测序深度覆盖率既Coverage指数在99.86%～99.90%左右，进一步表现出了测序深度足以检测粪便样本中的微生物群落信息.

图1 α多样性稀释曲线

2.2 群落组成分析

草青季岩羊的肠道菌群落中优势菌门为厚壁菌门Firmicutes(44.27%)、放线菌门Actinobacteriota(25.21%)、拟杆菌门Bacteroidota(23.26%)；草枯季优势菌门为放线菌门Actinobacteriota(64.39%)，厚壁菌门Firmicutes(16.27%)，拟杆菌门Bacteroidota(8.57%)，变形菌门Proteobacteria(6.46%).在属级水平上，草青季岩羊的肠道菌群落中优势菌属为节杆菌属Arthrobacter(20.54%)，Rikenellaceae_RC9_gut_group(5.56%)，UCG-005(5.19%)，Christensenellaceae_R-7_group(4.16%)；草枯季岩羊的肠道菌群落中优势菌属为节杆菌属Arthrobacter(54.83%),Rikenellaceae_RC9_gut_group(0.40%)，Christensenellaceae_R-7_group(3.49%)，从草青季到草枯季，门级水平上厚壁菌门Firmicutes减少了(28.00%)、拟杆菌门Bacteroidota减少了(14.69%)，放线菌门Actinobacteriota增多了(39.18%).在属级水平上，节杆菌属Arthrobacter增多了(34.29%)(图2).

图2 不同季节间岩羊肠道微生物群落相对丰度(A:门水平，B:属水平)

2.3 季节差异分析

通过对不同时期的岩羊肠道微生物菌群的LEfSe分析(|LDA score≥6|,P<0.05)，可以找出岩羊肠道菌群季节显著差异的分类单元.在进化分支图中，草青季和草枯季从门级到属级水平共发现了44个差异性特征，其中37种差异性特征在草青季，7种差异性特征在草枯季(图3-A).草青季拟杆菌纲Bacteroidia和拟杆菌门Bacteroidetes以及属水平上的Rikenellaceae_RC9_gut_group(图3-B)和草枯季差异性特征微杆菌科Microbacteriaceae，类诺卡氏菌Nocardioidaceace和丙酸杆菌目Propionibacteriales富集显著.

A.进化分支图：由内至外辐射的圆圈代表了由门至属的分类级别.在不同的级别上的每一个圆圈代表该级别水平下的一个分类，圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比.B.LDA值柱状图.

2.4 群落多样性分析

岩羊在草青季和草枯季的肠道菌群α多样性指数反映出了岩羊肠道微生物的丰富度和多样性(图4)，通过对两组样本进行指数间差异检验，发现草青季的Simpson指数、Shannon指数、Chao1指数和ACE指数(P<0.001)都高于草枯季.结果显示岩羊肠道菌群草青季的多样性和丰富度都高于草枯季.

图4 不同组间Alpha多样性指数

基于未加权的Unifrac的方法分别对20个样本采用进行PCoA分析，主成分PC1贡献率为21.51%，PC2的贡献率为10.63%.草青季和枯草季的样本各自聚在了一起(图5).利用Permanova test分析发现岩羊肠道微生物的组成具有显著的季节差异(F=3.92,P<0.001).

图5 草青季和草枯季祁连山岩羊肠道微生物PCoA分析

3 讨论与总结

肠道微生物有利于宿主的能量和物质的代谢，其组成与结构受食物资源种类和营养成分等因素的影响[20].本研究中，岩羊肠道微生物群落的组成与结构存在显著的季节差异，可能与季节变化导致其食物资源种类及食物资源营养成分变化相关.

祁连山处于我国三大高原的交界处，独特的地势条件，植物垂直带谱明显.在海拔3 km上的植被类型主要是高寒草甸，海拔2～3 km的植被类型主是灌丛[21].草青季岩羊生活在祁连山3 km以上的地区，进入草枯季后，岩羊从高海拔的区域迁徙至海拔2～3 km区域[22-23].在适应季节变化的迁徙过程中，岩羊的食物种类发生了明显的变化.食物资源种类变化能改变宿主肠道微生物的组成与功能[24].祁连山岩羊肠道微生物的组成差异可能与其食物资源种类的季节变化相关.

物候更替导致了植物营养成分改变，草青季植物体内粗蛋白、粗脂肪高于草枯季，草青季粗纤维比草枯季低[25].研究表明，摄入较高脂类将会导致宿主肠道菌群中厚壁菌门的比例增加[24]，拟杆菌门的菌群宿主吸收蛋白质等起着重要作用[26].本研究中岩羊草青季肠道菌群落中的厚壁菌门和拟杆菌门的组成比例高于草枯季，可能与草青季期食物资源体内的粗脂肪和粗蛋白高于草枯季相关.

此外本研究还发现，在草青季到草枯季时期门级水平上均出现了较高丰度的放线菌门，而放线菌门的菌种有利于宿主机体抵抗外来的病原体[27].在属级水平上均出现了较高丰度的节杆菌属，节杆菌属普遍存在于土壤中，其在土壤中存在的原因被认为是自身营养多态性[28]，而在脊椎动物的肠道中存在的节杆菌属能够把木糖转为短链脂肪酸[29]，节杆菌属在岩羊的肠道菌群存在可能主要与岩羊生活环境与营养有关.通过对岩羊肠道微生物进行α多样性分析发现，草青季的岩羊的肠道微生物多样性和丰富度都高于草枯季岩羊肠道微生物多样性，用指数间差异检验检验两组间的α多样性指数发现差异显著，从PCoA分析结果来看草青季和草枯季两组之间有明显的差异性.

综上所述，植被垂直带谱与物候更替导致食物种类和营养成分变化对祁连山国家级自然保护区野生岩羊肠道微生物群落的组成和多样性具有明显的影响.