人参皂苷Rg1对疲劳小鼠骨骼肌中TFAM和NRF-1基因表达的影响

孔凡秀，杨 琪，董佳萍，谢琳琳，王鹤霖，迟晓星

（黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319）

人参皂苷Rg1是一种重要的人参皂苷单体，目前在多领域都有对人参皂苷单体的功能性研究[1-4]，但在其抗疲劳作用方面的研究相对较少[5]。疲劳的产生伴随着能量的大量消耗，其中包括血糖与肌/肝糖原的消耗，同时伴随着疲劳产物的积累，机体调节协同机能失调等。

线粒体作为人体主要的产能场所，大量运动后机体内氧化磷酸化形成超氧化物等活性氧簇，这些活性氧簇的产生使线粒体机能衰退，导致膜活性下降，影响了线粒体电子的传递和氧化磷酸化的进行，导致ATP合成不足，造成机体运动能力下降，诱发运动性疲劳的发生。线粒体的功能结构与骨骼肌的功能密切相关[6]，线粒体转录因子A（TFAM）为线粒体DNA的上游调节基因[7-8]，TFAM能够与线粒体DNA相结合，形成一种类核复合体结构，此结构能够保护线粒体DNA（mtDNA）免受活性氧簇的损伤。作为一种由细胞核基因编码的线粒体蛋白质，除可参与线粒体的转录、复制及形成拟核结构等生物合成方面的功能外，还可以保护线粒体免受氧化损伤。核呼吸因子-1（NRF-1）参与多种核编码基因和TFAM等的表达[9]。NRF-1和TFAM等组成的信号通路在线粒体生物合成中起着重要的调节作用，参与mtDNA的转录和复制[10]。

作者通过强制小鼠力竭游泳造成小鼠疲劳运动模型，观察不同剂量人参皂苷Rg1对骨骼肌中抗氧化指标以及与线粒体生物合成密切相关的转录因子TFAM和NRF-1基因表达的调节作用，以期发现人参皂苷Rg1的抗疲劳作用及可能的作用途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要试剂人参皂苷Rg1（纯度98%）：南京斯道夫生物科技有限公司产品；环磷酰胺：江苏盛迪医药有限公司产品；乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、肝/肌糖原、蛋白质定量试剂盒：南京建成生物工程研究所产品。

1.1.2 主要仪器5424高速离心机：美国Eppendorf公司产品；紫外可见分光光度计：上海INESA公司产品；酶标仪：BioTec公司产品；恒温培养箱：DRP-9162上海森信公司产品；ABI-7300 Real-time检测仪：ABI公司产品。

1.2 动物与分组

雄性BALB/c小鼠70只，2月龄，体质量18~21 g，辽宁长生生物技术有限公司提供。小鼠按体质量随机分7组，每组10只，灌胃给药前，除空白静止和空白运动组外，其他组小鼠注射环磷酰胺制作免疫抑制模型。

人参皂苷Rg1用生理盐水溶解，Rg1低（L）、中（M）、高（H）剂量组的灌胃剂量分别为12.5、25、50 mg/kg[11]；空白静止组（BSG）、空白运动组（BEG）和模型组（MG）按体质量以等量生理盐水灌胃，阳性对照组（P）生理盐水溶解贞芪扶正颗粒，连续灌胃21 d。小鼠在温度为（20±2）℃、相对湿度为40%～60%、光/暗循环12 h环境下饲养。

1.3 小鼠免疫疲劳模型的建立

免疫低下和疲劳密不可分，免疫低下个体更易形成疲劳模型。将健康小鼠随机分组后，除BSG与BEG组腹腔注射生理盐水外，其余组腹腔注射环磷酰胺造模，根据文献[13-14]确定环磷酰胺剂量为30 mg/kg，连续7 d可造成小鼠免疫低下模型。每周两次进行无负重游泳训练，如出现直立性游泳、眼鼻渗血等不能顺利完成游泳者被淘汰。各实验组小鼠置于水中互不接触，不停驱赶使之不停游泳，游泳结束后尽快擦干小鼠皮毛。训练时间为20 min，周期为21 d。

1.4 小鼠负重力竭游泳实验

疲劳模型建立之后，除空白静止组外，小鼠进行负重游泳试验，末次灌胃半小时后，将小鼠尾巴根部绑紧其自身体质量5%的铅皮，放入水深35 cm、水温为（25±1）℃的游泳箱中，用秒表记录时间，沉没后10 s仍不能浮出水面，该时间为小鼠的力竭游泳时间[15-17]。

1.5 指标测定

1.5.1 疲劳和抗氧化生化指标测定小鼠处死后取肝脏、骨骼肌等组织，生理盐水漂洗后滤纸吸干，按试剂盒说明测定丙二醛（TBA法）、乳酸脱氢酶（微量酶标法）、肌/肝糖原（比色法）等生化指标。

1.5.2 小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表达水平测定取骨骼肌组织，提取总RNA，RT-PCR测定小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表达水平。

1）基因序列

管家基因引物序列：

目的基因引物序列：

2）骨骼肌RNA提取和鉴定 取小鼠骨骼肌100 mg，加TRIZOL提取RNA。通过变性琼脂糖凝胶电泳确定RNA完整性，并在紫外分光光度计测定RNA的质量浓度及纯度。

3）逆转录反应 取3μg RNA，以oligo（dT）为引物进行反转录，进行cDNA合成。20μL体系中含有5×RT缓冲液4μL，2.5 mmol/L dNTP混合液4μL，1μL RNA酶抑制剂，MMLV反转录酶1 μL，3.5μmol/L oligo（dT）引物1μL，RNA 3 pg，反应条件：37℃1 h，然后95℃保持5 min，冰上放置5 min，备用。

4）荧光定量PCR反应 样品按以下反应体系进行：10×PCR缓冲液2.5μ，MgCl2溶液3 pL，dNTP混合液3 pL，Taq聚合酶3 U，0.25 X Sybergreen，上游引物F（20 pmol/L）0.5 pL，下游引物R（20μmol/L）0.5 pL，cDNA 1μL，加ddH2O至总体积为25μL。反应条件为：95℃反应20 s，60℃反应20 s，72℃反应20 s，87℃反应10 s，共40个循环。反应结束后，电脑自动分析荧光信号并将其转换为Ct值。结合RNA浓度，将荧光定量PCR定量结果进行换算，得出待测样本的RNA表达量。

5）PCR产物定量分析的校正 采用Beta-actin作为内参照。将TFAM、NRF-1和内参基因Ct值之间的差值来计算基因表达差异。

1.6 数据处理

数据采用SPSS 20.0进行单因素方差分析，采用LSD法进行多重比较，数据均以均值±标准差（x±s）表示，以组间方差分析P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 小鼠负重游泳的力竭时间

从表1可以看出，与空白组相比，各剂量组小鼠负重游泳的力竭时间均有不同程度的延长，尤以中剂量组效果最为明显。与空白组和模型组相比，中剂量（25 mg/kg）的人参皂苷Rg1可显著延长小鼠的力竭游泳时间，增长率为271.4%，差异有显著性（P<0.01）。

表1 小鼠负重游泳力竭时间Table 1 Exhausted time of mice swimming with load

2.2 小鼠肝脏和骨骼肌中糖原水平

如图1所示，各组间肌糖原浓度无显著差异性。与模型组比较，中剂量人参皂苷Rg1组可明显增加小鼠肝糖原浓度（P<0.05），说明在中剂量时人参皂苷Rg1增加疲劳小鼠肝糖原的效果较好。

图1 人参皂苷Rg1对小鼠肝糖原和肌糖原浓度的影响Fig.1 Effects of ginsenoside Rg1 on glycogen levels of liver and skeletal muscle of mice

2.3 小鼠骨骼肌中MDA、LDH的水平

如图2所示，与MG组比较，人参皂苷Rg1各剂量组小鼠骨骼肌中MDA质量摩尔浓度均明显下降，差异具有显著性（P<0.01）。与空白静止组相比，模型组、空白运动组和低剂量组骨骼肌中LDH活性下降明显（P<0.01）；与模型组和空白组相比，中、高剂量组小鼠骨骼肌中LDH活性增加显著（P<0.01）。

图2 人参皂苷Rg1对小鼠骨骼肌中MDA和LDH的影响Fig.2 Effects of ginsenoside Rg1 on MDA and LDH content in skeletal muscle of mice

2.4 小鼠骨骼肌中TFAM和NRF-1基因表达水平

从图3可以看出，与模型组相比，中剂量人参皂苷Rg1可显著增加小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表达水平，说明人参皂苷Rg1在25 mg/kg的剂量下，对骨骼肌中线粒体相关因子的调节作用最好，从而提高线粒体的生物合成，使线粒体氧化供能增强。

3 结 语

目前已有研究发现，人参皂苷Rg1主要是通过加速自由基清除率、增强体内抗氧化物酶活性、维持血糖水平、促进糖原合成等方面共同协作发挥抗疲劳作用。疲劳的产生通常伴随着能量的大量消耗，其中包括血糖与肌/肝糖原的消耗，同时伴随着疲劳产物的积累，机体调节协同机能失调等[18]。本研究结果显示，中剂量的人参皂苷Rg1显著增加了小鼠肝糖原浓度，可有效减少能量消耗。有学者通过实验证实，小鼠灌胃人参提取物后可延长力竭负重游泳时间，具有抗疲劳作用。宋姌和刘涛[19]研究发现，人参皂苷Rg1可明显降低慢性疲劳综合征大鼠脂质过氧化物丙二醛的含量，同时增强抗氧化酶SOD的活性，说明人参皂苷Rg1能够提高抗氧化酶系统活性并减轻脂质过氧化代谢产物的堆积，具有良好的抗疲劳作用。王莹等研究表明，人参皂苷Rg1能显著延长小鼠力竭游泳时间，降低血清中尿素氮水平，同时维持血糖水平，增加肌糖原和肝糖原储备，显著降低小鼠运动后血乳酸浓度，以上研究结果与本实验结果基本一致。在本实验中，小鼠游泳运动后与正常运动组小鼠比较，肝和骨骼肌中MDA质量摩尔浓度并无显著性差异。在给予人参皂苷后，各剂量组的人参皂苷对骨骼肌组织中的MDA质量摩尔浓度均有降低作用。

图3小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表达水平Fig.3 Expression of TFAM mRNA and NRF-1 mRNA in skeletal muscle of mice

TFAM基因的启动子上具有多种调节因子的识别位点，其中NRF-1占主导位置，二者与DNA结合后可增高其mRNA的表达及升高TFAM的蛋白质合成，从而增加线粒体进行生物合成[9]。NFR-1的主要作用是调控mtDNA的表达，包括线粒体转录因子A（TFAM），其中TFAM在调控mtDNA表达及线粒体基因组复制中起重要作用。TFAM是mt DNA复制转录的直接调控子[21]，学者通过敲除了TFAM基因的大鼠发现，mtDNA的复制明显减少，并且线粒体电子传递能力受到损伤[22]。线粒体功能的改善可能与TFAM的大量表达相关联，其作用还有参与调节线粒体的转录机制[20]。NRF-1能调控多种线粒体蛋白质的表达[12]。TFAM可在NRF-1的作用调节下激活，对mtDNA的复制与转录起着重要的调控作用。赵婷婷等研究证实，一次长时间大鼠游泳后能促进骨骼肌中PGC-1α与TFAM mRNA的共同表达，黄芪丹参复合物可通过p38MAPK-PGC-1α-NRF-1-TFAM途径促进线粒体生物发生。实验结果显示：不同剂量的人参皂苷Rg1可同时上调NRF-1和TFAM基因的表达，以中剂量组（25 mg/kg）效果最明显，说明人参皂苷Rg1可激活NRF-1在线粒体转录因子A（TFAM）启动子上的转录功能，而TFAM是线粒体生物合成的直接调控因子，因此证明人参皂苷Rg1可改善线粒体功能和修复肌细胞的损伤，对骨骼肌肌细胞产生保护作用。

人参皂苷Rg1对疲劳模型小鼠的疲劳相关指标肝/肌糖原以及骨骼肌中抗氧化指标有很好的调节作用，并能有效调节骨骼肌中线粒体合成过程中的重要因子的表达水平，从而起到抗疲劳的作用。