Calm1基因敲除小鼠脑蛋白质组学特点及临床意义

李华欣 马宾 刘晓芬 丁莹梅 袁梅

(1南华大学附属第二医院神经内科，湖南 衡阳 421001；2南华大学衡阳医学院)

钙离子钙信号在生命活动中承担重要作用，钙信号既是细胞外信使又是细胞内信使，在细胞中影响基因表达、细胞生长、发育、存活甚至死亡。而钙调蛋白(CaM)是真核生物细胞中最主要、最普遍的钙传感器〔1〕和换能器，通过与钙离子结合调节其他蛋白质的结构和功能从而充分发挥钙离子的作用。在脑中，CaM主要与急性脑梗死〔2，3〕、阿尔茨海默病〔4〕、癫痫〔5，6〕和帕金森病〔7〕有关。前期研究主要集中在CaM与急性脑梗死关系及其机制〔8，9〕。2015年，本课题组研究发现急性脑梗死患者血浆CaM水平与正常对照组相比表达显著增加〔9〕。而使用钙调蛋白拮抗剂〔10，11〕抑制CaM表达可以减轻急性脑梗死后脑损伤。在人体，CaM 由3个非等位基因CALM1、CALM2、CALM3编码〔12〕，都编码产生CaM，其中研究最普遍和广泛的基因是CALM1(小鼠的同源基因是Calm1)。为进一步探索CaM在缺血性脑卒中的作用，本文构建了Calm1基因敲除小鼠模型。 蛋白质组学作为一种高通量筛选方法，近来在神经系统疾病相关研究〔13，14〕中越来越受到关注。蛋白质是细胞功能的最主要执行者，细胞中异常表达的蛋白质或蛋白质修饰改变可能引发一系列疾病。本研究采用TMT标记的定量蛋白组学技术，全面检测野生型(WT)、纯和型(HO)、杂合型(HE)小鼠脑组织蛋白质表达谱，结合生物信息学GO、KEGG和STRING分析来探究差异蛋白涉及的功能及参与的信号通路，以期从宏观角度上发现Calm1表达改变涉及的差异蛋白标靶，为探究Calm1表达改变对脑组织功能影响及其作用机制提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 C57BL/6J小鼠由上海南方模式生物科技有限公司提供，为Calm1-eKO1基因敲除小鼠模型，交配后获得WT(+/+)、HE(+/-)和HO(-/-)小鼠。实验动物合格证编号：20170010002299。实验小鼠被饲养于南华大学实验动物学部进行繁殖育种和实验，喂食大小鼠维持饲料和繁殖饲料。经PCR产物大小方案鉴定小鼠基因型。对实验动物的处理及动物实验的开展均符合动物伦理学标准，并经南华大学医学伦理委员会(编号：2018-02-0002)审查通过。3种基因型小鼠各3只，鼠龄3.0～4.1 w，平均3.5 w，分为WT组、HE组和HO组。PCR实验采用引物序列为P1：5′-TGAAACCTGGATTGGTAACCCA-3′；P2：5′-CATCACGACACTTAATGGCGC-3′；P3：5′-GACGGCACCATCACAACCAA-3′。

1.2标本采集及运输 小鼠禁食12 h，自由饮水。经5%水合氯醛腹腔注射将小鼠麻醉后固定在橡皮胶垫上，先用眼科剪剪开小鼠胸腔暴露心脏，再使用宽头无齿镊子小心夹持固定心脏，最后将1 ml注射器针头插入左心室，缓慢注射4℃无菌磷酸盐缓冲液(PBS)灌注，灌至肝脏变成纯桃黄色。小鼠断头取完整脑组织，4℃无菌PBS轻轻冲洗，滤纸吸干表面水分，置于液氮速冻保存，干冰运输。所有小鼠脑组织标本在质谱检测前避免反复冻融。

1.3主要试剂与仪器 麻醉药水合氯醛购于上海麦克林公司；二硫键还原剂TCEP〔tris(2-carboxyethyl) phosphine〕、烷基化剂IAA(iodoacetamide)、用于蛋白重溶的100 mmol/L HEPES和SDC(sodium deoxycholate)、用于TMT标记的Hydroxylamine、Anhydrous acetonitrilel均购于美国 Sigma-Aldrich公司；用于配制RIPA裂解液的试剂购于上海生工生物公司、美国Sigma-Aldrich公司；测序级胰蛋白酶购于美国Promega公司；TMT标记试剂TMT10-plex Isobaric Label Reagent Set购于美国Thermo Fisher Scientific公司；蛋白酶抑制剂购于上海数谱生物公司；用于质谱分析的试剂购于美国 Sigma-Aldrich公司、美国J.T.Baker公司；其余试剂至少为国产分析纯试剂级别。Q Exactive质谱仪、1200液相色谱系统、混匀器均购于美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.4蛋白提取 取小鼠全脑组织，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆使充分裂解，注意冰上操作。提取蛋白后，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定每份脑组织蛋白浓度。取96孔板，每孔加入标准蛋白或待测样品20 μl，工作液160 μl，37℃摇床震荡孵育30 min，酶标仪检测562 nm波长处的光密度(OD)值。绘制标准蛋白曲线(R2>0.95)并根据标准曲线计算相应样品的浓度和蛋白总量。聚丙烯酰胺凝胶电泳上样20 μg，考马斯亮蓝染色检测蛋白质量。

取上述样品加用裂解液稀释至蛋白浓度为1 mg/ml。再加入TCEP在55℃条件下孵育10 min还原二硫键。采用IAA避光反应15 min，烷基化TCEP还原的二硫键。加入4～6 倍体积预冷的丙酮充分混匀，沉淀蛋白。4℃条件下10 000 r/min离心10 min，弃上清。加入200 μl预冷的80%丙酮洗涤沉淀，重复2次后收集沉淀。按次序先后加入含1% SDC 的100 mmol/L HEPES、再悬浮缓冲液、2 μg trypsin溶液分别反应，简单离心后37℃震荡孵育过夜使蛋白充分溶解。再高速离心10 min，留取上清至新EP管中。

1.5TMT标记 取出TMT标记试剂平衡至室温。每管试剂中加入41 μl无水乙腈(ACN)溶解并离心，吸取20 μl TMT 溶液至待测样品中，混匀后离心，室温孵育1 h，加入羟氨室温再孵育15 min终止反应。各待测样品等量混合。加入TFA沉淀SDC，提取共沉淀的多肽，重复2次，最终得到的上清即为标记的多肽样品。使用C18脱盐柱给多肽样品脱盐，真空干燥，-80℃ 冻存或加入0.1% FA，H2O，2% CAN配成的缓冲液重溶至浓度为1 μg/μl的多肽溶液。取100 μg多肽样品，经HPLC反向柱层析系统(流动A相：10 mmol/L甲酸铵水溶液，pH=10；流动B相：10 mmol/L甲酸铵，10% H2O，90% ACN，pH=10)梯度洗脱，然后经XBridge BEH C18 XP Column(150 mm×2.1 mm)分离，每30 s收集一个组分，收集 120份，随后合并为12 个组分，再经真空干燥后-80℃冻存。

1.6液相色谱-串联质谱联用分析(LC-MS/MS) 每个组分取2 μg多肽经nano-UPLC 液相系统EASY-nLC1200 以300 nl/min恒定流速进行分离。分析采用100 μm ID × 15 cm 反相色谱柱(Reprosil-Pur 120 C18-AQ，1.9 um，Dr.Math)。流动相A 液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为2%)，B 液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为80%)。色谱柱以100%A 液平衡。液相梯度设置：流动相B：8%～35%持续70 min，35%～45% 持续12 min，45%～100% 持续2 min，100%持续2 min，2%持续2 min。

分离后的肽段连用Q-Exactive 质谱仪(Thermo Finnigan) 在线进行质谱分析。分析时长：120 min/sample，正离子检测模式，母离子扫描范围350～1 600 m/z。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序。每次全扫描后采集20个碎片图谱(MS2 scan，HCD)。MS1在200 m/z时分辨率为70 000，MS2在200 m/z时分辨率为35 000；MS1 AGC为3E+6，MS2 AGC 为1E+5，最大离子注入时间(Max IT)：MS1，50 ms；MS2，45 ms。标准化碰撞能量(NCE) 为32%，隔离窗口为2 m/z，动态排除时间30 s。

1.7MaxQuant搜库和TMT定量 LC-MS/MS原始数据使用MaxQuant 1.6.1.0进行搜库和定量分析。蛋白数据库为：uniprot-mouse-20200526.fasta；定量方式为二级报告子定量，16标TMT，标记位点为多肽N末端和Lys(K)，PIF设为0.75。特异性酶为trypsin/P，最大漏切数2；可变修饰有Oxidation(M)，Acetyl(protein N-term)，固定修饰 Carbamidomethyl(C)；最小多肽长度为7，最大多肽分子量4 600 Da；多肽和蛋白水平FDR均控制在0.01；用于定量的多肽包括Unique，可变修饰的多肽不用于定量；同时进行iBAQ非标定量。

随后对9个样品进行标准化：性质相似的生物样品中绝大部分蛋白表达水平应该是不变的，只有少数蛋白会出现差异表达；根据这个原理，将各组样品标准化，使各组样品总蛋白或中位数一致。

1.8统计检验和生物信息学分析 随后对标准化后的定量结果进行统计学分析，得到对应的差异表达蛋白。本实验含3个生物学重复，将差异倍数(FC)>1.2或FC<1/1.2，P<0.05，单肽≥2的蛋白定义为差异显著，并进行后续GO、KEGG通路、蛋白相互作用分析和展示。

2 结 果

2.1小鼠基因型鉴定 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图像显示：WT小鼠扩增出DNA片段约为818 bp；Calm1基因敲除HO小鼠扩增出DNA片段约为979 bp；Calm1基因敲除HE小鼠扩增出DNA片段约为979 bp+818 bp，见图1。

图1 PCR扩增产物凝胶电泳图像

2.2总蛋白及DEPs鉴定和筛选 本实验多肽和蛋白水平错误发现率(FDR)均控制在0.01，多肽总数22 387个，蛋白质总数4 595个，可定量蛋白数4 529个。C-A组中，显著上调蛋白23个，显著下调蛋白31个，共54个差异蛋白质(DEPs)；C-B组中，显著上调蛋白19个，显著下调蛋白16个，共35个DEPs；C-A组、C-B组取交集，只有一个交集蛋白质：Sorbs3；C-A组DEPs火山图上调最显著的5个蛋白质是Ctif、Gpr17、Hsph1、Ttn、Ugt8a，下调最显著的为 S100a5、Cirbp、Nqo1、Gng10、Ass1。C-B组上调最显著的5个蛋白质是Ahnak2、Sorbs3、Fam81a、Timm9、Col1a1，下调最显著的为 Cox7a2、Cox5a、Cox6c、Cox6b1、Cdk13。见图2。

2.3KEGG 通路分析 KEGG通路富集分析结果显示，C-A组54个DEPs富集在11条通路中，C-A组上调的23个DEPs富集在20条通路中，C-A组下调的31个DEPs富集在16条通路中。

C-B组的35个DEPs富集在18条通路中，C-B组上调的19个DEPs富集2条通路中，C-B组下调的16个DEPs富集在16条通路中，见图3。

图2 DEPs火山图

图3 KEGG通路富集分析结果

2.4GO富集分析 GO富集分析结果显示，C-A组54个DEPs富集在生物学过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)分别有32、22、27条，其中，C-A组上调的23个DEPs富集在BP、CC、MF分别为12、7、39条，C-A组下调的31个DEPs富集在BP、CC、MF有37、29、39条。

C-B组35个DEPs富集在BP、CC、MF分别有134、86、47条，其中，C-B组上调的19个DEPs富集在BP、CC、MF分别有175、52、32条，C-B组下调的16个DEPs富集在BP、CC、MF各共有104、56、43条，见图4。

图4 GO富集分析结果

2.5蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建 PPI网络采用STRING数据库进行构建，隐藏无连接节点的基因进行展示。然后将STRING 产生的蛋白相互作用参数导入Cytoscape(版本：3.8.2；https：//cytoscape.org/)，利用CytoHuabba插件，再采用最大集团中心度(MCC) 算法筛选排名前10的关键基因。C-A组27个DEPs相互作用如图5A所示，前10的关键基因按中心度依次排列为Hsp90ab1、Hsp90aa1、Nqo1、Ephx1、Gstm5、Gstm1、Tomm34、Hsph1、Calm1和Acss2，显示如图5B。C-B组20个DEPs相互作用如图6A所示，前10的关键基因按中心度依次排列为Cox4i1、Cox7a2、Cox5b(Gm11273)、Cox6b1、Cox5a、Cox6c、Cox7c、Sod1、Nefh和Nefl，显示如图6B。

A：隐藏无连接节点后，27个DEPs的相互作用；B：使用Cytoscape作图软件中CytoHubba插件按中心度筛选出来的10个关键基因；红色表示连接度高，黄色表示连接度低；椭圆节点表示上调，菱形节点表示下调图5 C-A组DEPs相互作用分析

A：隐藏无连接节点后，20个DEPs的相互作用；B：使用Cytoscape作图软件中CytoHubba插件按中心度筛选出来的10个关键基因；红色表示连接度高，黄色表示连接度低；椭圆节点表示上调，菱形节点表示下调图6 C-B组DEPs相互作用分析

2.6重要DEPs的表达量聚类分析 根据C-A、C-B两组上调、下调最显著的10个DEPs，C-A、C-B两组连接度最高的10个关键蛋白质。对C-A、C-B两组筛选出来的上述DEPs聚类后制作热图，见图7。

图7 差异蛋白质聚类分析

3 讨 论

本研究发现，Calm1敲除后，涉及的DEPs主要在神经退行性疾病中发挥了作用。C-A、C-B两组中涉及的通路主要包括多巴胺能突触(Dopaminergic synapse，Calm1/Gng10/Th，下调)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Cox6b1，下调)、肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Nefl/Nefm/Sod1/Cox6b1/Nefh，下调)、帕金森病(Parkinson disease，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Cox6b1，下调)、亨廷顿病(Huntington disease，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Sod1/Cox6b1，下调)、多种神经退行性疾病(Pathways of neurodegeneration-multiple diseases，Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Nefl/Nefm/Sod1/Cox6b1/Nefh，上调下调均有)、朊病毒病(Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Sod1/Cox6b1，下调)。朊病毒病是一种具有高度传染性的神经退行性疾病，能够通过引起特定蛋白质的错误折叠、聚集和沉淀，从而引起肌萎缩性侧索硬化症的渐进性加重〔15，16〕。上述通路中DEPs主要包括细胞色素C氧化酶多种亚基(Cox4i1/Cox5a/Cox5b/Cox6c/Cox7a2/Cox7c/Cox6b1)，与阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病和亨廷顿病通路均有关联；包括神经丝轻、中、重多肽(Nefl/Nefm/Nefh)，其中，Nefh与轴突成熟有关且通常用作神经元损伤的生物标志物，与肌萎缩侧索硬化有关；包括超氧化物歧化酶〔Cu-Zn〕(Sod1)，该基因的突变被认为是肌萎缩侧索硬化的原因〔17，18〕，还与亨廷顿病有关。

CaM通过直接参与β淀粉样蛋白质的产生、神经元纤维缠结的形成及调控下游的CaM结合蛋白与阿尔茨海默病有密切联系〔4〕；CaM调控多种钙离子通道，参与维持细胞内钙离子稳态，CaM的高表达或活性增强也可能导致CaM结合蛋白的过度激活而对细胞产生毒害作用，有实验表明抑制CaM结合蛋白的表达在帕金森病动物模型和患者中都带来了有益影响〔7〕；2016年，研究人员采用蛋白质组学分析方法探究肌萎缩侧索硬化患者的发病机制，也发现患者脊髓组织神经元胞体和树突中CaM的表达普遍降低〔19〕，这可能是破坏了钙稳态；CaM与亨廷顿病〔20，21〕有关联，CaM片段的表达(由CaM的76～121位氨基酸组成)降低了CaM与突变的亨廷顿蛋白、转谷氨酰胺酶修饰的亨廷顿蛋白的结合及与突变体亨廷顿蛋白相关的细胞毒性和标准化的细胞内钙释放，CaM片段的表达改善了亨廷顿病R6/2小鼠模型的运动功能；细胞色素C氧化酶相关蛋白参与构成线粒体有氧呼吸复合体Ⅳ，与线粒体功能的正常发挥密切相关；已有证据表明线粒体特别是突触前神经元中的线粒体功能障碍是神经退行性疾病的重要原因〔22，23〕，敲除Calm1，CaM表达降低可能通过下调细胞色素C氧化酶相关蛋白的表达从而引起Calm1敲除小鼠的神经退行性疾病发生和发展，具体是否有关联还有待进一步验证。CaM表达水平增高或活性增强，敲除Calm1使得CaM表达减低都有可能引起神经退行性疾病，但总的来说，抑制CaM的表达能够一定程度改善神经退行性疾病患者的预后，但其明确的抑制程度也有待进一步研究。

研究发现，敲除Calm1，CaM表达降低，除与神经退行性疾病有关外，还可能通过调控乙醚脂质代谢通路(Ether lipid metabolism，Pld3/Ugt8a，上调)从而参与癌症〔24〕。通过坏死性凋亡通路(Necroptosis，Hsp90ab1/Hsp90aa1，上调)从而参与神经发育〔25〕，参与阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化等神经退行性疾病有关，还参与癌症〔26〕。既往文献对Calm基因突变(CaM表达降低)的研究主要与临床上危及生命的恶性心律失常有关〔27，28〕，包括儿茶酚胺能多形性室性心动过速〔29〕、长QT综合征(LQTs)〔30〕、特发性心室颤动(IVF)〔31〕；此外，研究人员于2019年还发现Calm基因突变(CaM表达降低)与神经系统病变有关〔28〕，包括癫痫发作、神经发育迟缓、运动和(或)认知功能障碍，但并未描述引起神经系统病变的相关机制。2018年，研究人员通过CRISPR Cas9技术置换Calm1中77处的甲硫氨酸编码碱基，发现这种基因编辑的小鼠纯合子在包括莫里斯水迷宫和联想学习的学习测试中的表现与WT小鼠相比，并没有统计学意义上的改变〔32〕。这些发现说明，CaM不仅在神经系统研究中很有意义，在恶性心律失常、许多癌症的防治中也有重要意义，还需更深入的联合研究。

既往Calm基因相关研究对象多为患者血清样本或已发表文献，采用全外显子组测序(WES)、靶向二代测序(NGS)或Sanger测序方法研究基因之间的相互关系及对生物体的影响〔27，28〕。本研究应用最新的TMT标记定量蛋白组学方法，方法上较基因组学筛查方法在基因的功能及其调控机制研究上更为全面和可靠。同时，研究对象为基于CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建和培育的Calm1稳定敲除HO、HE和WT小鼠，在模型上具有原始创新性。本研究首次揭示了Calm1敲除后小鼠脑组织的蛋白组学变化特征，初步提示了DEPs涉及的生物学功能及信号通路。Calm1敲除后显著改变脑组织中蛋白质表达特征并影响多条与神经退行性疾病关系密切的信号通路，表明CaM异常表达在神经系统疾病的发病中起到重要作用。