放射性视神经病变相关microRNA筛选及其应用价值

张丽娜，吴伯乐，黄武，倪丽莎，胡夏云

放射性视神经病变（RION）是头颈部肿瘤放射治疗后的严重并发症，可导致完全失明的一种放射性损伤[1-2]。已有研究报道，在视网膜尤其是视网膜神经节细胞中，microRNAs存在差异表达并具有组织特异性特点[3]，这些差异表现出明显相关性。近期有研究报道放射损伤可导致组织细胞microRNAs表达谱发生改变[4]，如Templin等[5]对部分接受1.25 Gy X射线照射后的人群进行分析后发现，照射后外周血中有45种microRNAs表达水平明显上调，并导致相应的靶基因表达水平降低，这表明外周血micro-RNAs差异表达可作为放射损伤的分子标志物。本研究对RION相关microRNA进行筛选，并探讨其临床诊断价值，现报道如下。

图5 中重度IBD患者治疗前肠黏膜组织VEGF-A表达（免疫组化染色，×200）

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年1月至2021年6月浙江省丽水市人民医院接受头颈部放疗并发生RION患者16例（RION组）和同期未发生RION的头颈部放疗患者16例（对照组），并选取视网膜神经节细胞株（RGC-5）（购自美国ATCC细胞库）为研究对象。纳入标准：（1）头颈部肿瘤诊断明确；（2）拟行调强放疗；（3）签署知情同意书。排除标准：（1）普通放疗者；（2）合并视神经病变者；（3）放疗前接受过化疗者。RION组男9例，女7例；平均年龄（48.2±14.2）岁；原发病为鼻咽癌7例，脑肿瘤8例，淋巴瘤1例。对照组男8例，女8例；平均年龄（46.6±16.6）岁；原发病为鼻咽癌9例，脑肿瘤7例。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 放射损伤模型的构建 应用直线加速器对RGC-5细胞进行照射，吸收剂量分别为0、2、4和8 Gy，照射后于不同时间在显微镜下观察细胞的形态变化，分析放射损伤后不同时间点RGC-5细胞的活性。

1.2.2 Real-time PCR检测放射前后microRNA表达情况 根据RION相关差异表达microRNA分子序列，委托深圳吉玛基因公司合成相关的microRNAmimics（模拟分子）和inhibitor（抑制分子），并采用lipo2000转染试剂进行细胞内转染，分别上调和下调RGC-5细胞内相关差异microRNA的过表达和低表达。转染后检测目标microRNA的表达及对RGC-5细胞放射损伤的影响。

1.2.3 标本留取 患者于接受放疗前及放疗后分别留取外周血，并提取总RNA后放置于－80℃冰箱中待检。

1.3 统计方法 采用STATA8.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析；计数资料采用2检验；采用贝叶斯定理评价RION相关差异表达mciroRNA预测或早期诊断RION的临床价值，并采用受试者工作特征曲线（ROC）进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RGC细胞系培养及放射模型 照射后4 Gy组和8 Gy组较其他两组细胞生长和形态发生明显改变（封三彩图1）；MTT法检测发现随着照射时间的增加，2、4和8 Gy组细胞存活率较0 Gy组均下降（均P＜0.05），见封三彩图2。

图1 倒置显微镜下观察不同剂量X射线照射后细胞形态注：A为0 Gy组，B为2 Gy组，C为4 Gy组，D为8 Gy组

图2 不同剂量组细胞存活率比较注：*＜0.05

2.2 microRNA差异表达情况 RGC-5细胞接受8 Gy照射7 d后，有9个microRNA表达水平变化不明显，而miR-192和miR-34a表达明显上调（F=8.56、11.23，均P＜0.05），见封三彩图3。

图3 micorRNA不同放射剂量表达水平比较注：A为不同剂量组的热图；B为不同剂量组microRNA表达水平变化曲线

2.3 RION组和对照组miR-192、miR-34a表达情况RION组和对照组放疗前miR-192分别为0.53±0.22和0.50±0.23，miR-34a分别为0.60±0.31和0.67±0.38，两组miR-192、miR-34a差异均无统计学意义（t=0.67、0.58，均P＞0.05），RION组放疗后miR-192和miR-34a分别为1.13±0.42和1.16±0.41，均高于对照组的0.49±0.14和0.61±0.25（t=5.84、4.35，均P＜0.05）。

2.4 miR-192和miR-34a预测RION的价值分析以放疗结束后血清miR-192为参考，预测RION的敏感性和特异性分别为93.75%和81.25%，ROC曲线下面积为0.97，截断值为0.73；以放疗结束后血清miR-34a为参考，预测RION的敏感性和特异性分别为87.75%和75.00%，ROC曲线下面积为0.88，截断值为0.92。见封三彩图4。

图4 miR-192和miR-34a预测RION的ROC曲线

3 讨论

临床上通常将RION分为前部视神经损伤和后部视神经损伤两种类型。前部视神经损伤为急性放射损伤，一般发生在急性放射暴露或眼眶肿瘤大剂量放疗后，表现为视乳头出血水肿，视网膜管闭塞呈白线状，多为大剂量电离辐射直接损伤和神经所致出血水肿[6]。后部视神经损伤具有一定的潜伏期，早期眼底检查正常，从视神经损伤到出现临床症状为放疗后数月甚至数年，因此又称迟发性RION[7-8]。

随着放疗技术的提高及剂量分割等放疗方法的改进，急性放射损伤已非常少见，通常所指RION一般多为迟发性RION。动物实验及临床研究证明，视神经和视交叉对放射线敏感性较高，放射线导致视神经损伤的机制包括：（1）电离效应；（2）导致微循环障碍；（3）氧化损伤；（4）细胞DNA损伤等[9]。这些损伤机制能够解释急性RION的损伤原理和病理特点，而迟发性RION的发病机制目前尚不完全清楚。如何明确迟发性RION不同阶段的发生、发展规律和组织病理学特点，并在此基础上揭示其发病机制，是实现RION早期诊断的前提，也是对RION进行有效治疗的基础[10]。RION多为双眼先后发病，初期没有任何症状，待患者视力出现明显下降时则神经已发生萎缩。目前临床上尚缺乏针对视神经萎缩的确切治疗方法，因此放射性神经损伤预后极差，给患者带来了极大的痛苦。目前多数学者已达成共识，只有对早期诊断的RION患者进行积极的高压氧治疗，才能挽救并保留部分视力。然而，目前尚没有任何一种方法能够对放射暴露后的人群进行RION实时监测，也没有任何技术手段或标志物能对RION进行早期诊断。Lee等[11]甚至认为，对于已经发病的RION患者目前任何相关治疗方案都未被证实有效。如何对RION进行实时监测和早期诊断，以便尽早采取预防和治疗措施，已经成为制约RION防治的难题和瓶颈。

图6 中重度IBD患者治疗后肠黏膜组织VEGF-A表达（免疫组化染色，×200）

图7 对照组肠黏膜组织VEGF-A表达（免疫组化染色，×200）

图8 血清miR-19b、miR-9及miR-155-5P及联合检测诊断ESCC的ROC曲线

目前，将microRNAs作为RION分子标志物的相关研究在国内外鲜有报道。本研究结果显示照射后4和8 Gy组较其他各组细胞生长和形态发生明显改变，这提示视网膜神经节细胞对放射较为敏感，且存在剂量依赖性。随着照射时间的增加，2、4和8 Gy组细胞存活率较0 Gy组有显著差异（P＜0.05）。同时本研究证实miR-192和miR-34a表达在放射治疗后明显上调，这提示miR-192和miR-34a可能与RION的发生及发展有关。临床研究进一步发现以放疗结束后血清miR-192为参考，预测RION的敏感性和特异性均较高，因此，miR-192和miR-34a可作为预测其发生的血清学标志物。同时，进一步对miR-192和miR-34a参与RION的分子机制进行研究，有望开发出预防或治疗RION的microRNA靶向药物。

本研究也存在一定的局限性，首先纳入RION患者的例数较少，导致统计学效能不高。其次，不同患者接受的放疗剂量存在一定差异，这些差异可能是导致RION发生及microRNA表达变化的重要原因。因此，后续应加大样本量，同时进行回归分析，降低混杂因素对RION发生的影响，进一步明确microRNA在RION发生及发展中的作用及其作为预测生物学标志物的可行性。