基于网络药理学及分子对接方法研究复方三黄酊抗菌机制

马 静 蔺婷婷 孙绍伟 贺倩倩 吕文文 满玉清

1 滨州医学院药学院 山东 烟台 264003； 2 滨州医学院附属医院药学部 山东 滨州 256603

复方三黄酊由黄柏、黄连、黄芩以及冰片等组成，可以有效地治疗伤口炎症、止痛以及消除肿胀等。其可用于治疗各期褥疮、皮肤溃疡和 Ⅱ 度以下烧烫伤等[1]。湿敷可以让药液迅速渗透和发挥作用[2]。该药在临床应用中疗效显著，目前对其制药工艺、含量测定、成分鉴定、体外抑菌活性、临床疗效等方面已经进行了较多研究，但对复方三黄酊发挥抗菌作用的药效成分及作用机制缺乏整体的认识。

随着生物信息学的发展，网络药理学作为一种新的研究模式被广泛应用于医学领域[3]。其结合了计算机技术、系统生物学、基因组学、网络生物学等，可用于研究中药的潜在药理活性和作用机制[4]，创建药物—成分—靶点—通路—疾病相互作用的网络拓扑模型。中药往往存在多种成分，作用于多个靶点，通过多条通道发挥作用，这就需要对中药的作用机制进行共同的、系统的研究，所以基于生物信息学的网络药理学的方法对研究中药的作用机制有重要的意义[5-6]。本研究旨在利用网络药理学技术，为进一步研究复方三黄酊的抗菌作用机制和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 复方三黄酊化学成分收集、作用靶点的筛选及疾病靶点基因的预测 应用TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com/)收集黄柏、黄连、黄芩和冰片四味中药各自的化学成分和产生作用的活性成分靶蛋白。应用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库匹配靶蛋白与靶点基因。以“anti-bacterial”作为检索词输入GeneCards网站(https://www.Genecards.org/)，检索抗菌作用的相关靶点基因。

1.2 收集成分与疾病的共有靶点 应用Venny 2.1.0分析工具收集和成分相关的对应靶点以及疾病对应靶点之间的有共有交集靶点。

1.3 构建复方三黄酊的“药物—成分—靶点”网络体系 应用 Cytoscape 3.7.1 软件绘制复方三黄酊“药物—成分—靶点”网络拓扑模型。

1.4 创建复方三黄酊具有抗菌活性的相互作用蛋白网络 输入STRING平台(https://string-db.org/)共有靶点，物种设置为“智人”，最小交互阈值设置为“中等置信度”(>0.4)，获得蛋白相互作用网络，根据参数筛选关键靶点基因。

1.5 关键靶点基因功能分析及信号通路富集分析 为了进一步分析上述选择的关键靶点基因的生物学功能，预测复方三黄酊的抗菌活性作用机制，本研究将筛选得到的关键靶点基因输入到Omicshare数据库中(https://www.omicshare.com/tools/)，以物种为人(Homo sapiens)作为筛选条件，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.6 成分—靶点分子对接 运用分子对接技术验证预测的关键活性成分和关键靶点的相互作用关系。应用PDB(http://www.rcsb.org/)网站查找关键靶点蛋白结构，通过MOE软件将关键靶点与活性化合物进行分子对接验证，应用Discovery Studio分子建模软件将与各靶点蛋白结合能最高的化学成分对接结果可视化。

2 结果

2.1 疾病对应靶点基因 在TCMSP 数据库中发现复方三黄酊化学成分的342个潜在靶点基因。在GeneGards数据库中发现了1 878个与抗菌疾病相关的靶点基因。

2.2 复方三黄酊中化学成分对应靶点与疾病作用靶点的交集靶点 从具有与抗菌相关靶点基因中提取出与复方三黄酊的化学成分作用靶点的交叉靶点，得到复方三黄酊-抗菌共同靶点179个(图1)。

图1 复方三黄酊化学成分作用靶点与抗菌相关靶点基因的韦恩图

2.3 “药物-成分-靶点”网络体系 应用Cytoscape 3.7.1软件将179个共有靶点基因构建“药物—成分—靶点”的网络体系(图2)。结果显示，该网络共有373个节点，1 673条边。根据网络参数筛选出degree排名前10位的化合物槲皮素、丁香油酚、β-谷甾醇、药根碱、汉黄芩素、4-羟基肉桂酸、油酸、黄藤素、黄连碱、棕榈酸。

2.4 蛋白相互作用网络图构建、关键靶点基因筛选结果 在STRING平台利用179个交集靶点基因构建PPI网络(图3)，其中包含179个节点和3 817条相互作用连线。根据度值筛选出INS、AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、MAPK1、MYC、EGF、EGFR、PTGS2、MMP9、IL1B、CXCL8、ESR1、CCND1、FOS、CAT、CCL2、ACTB、PTEN、IL10、CYCS、MMP2、PPARG、MAPK14、ICAM1、NOS3、ERBB2、IL4、BCL2L1、RELA、HMOX1共35个关键靶点基因。PPI网络提示这些蛋白在复方三黄酊抗菌作用中发挥关键作用。

图2 复方三黄酊“药物—成分—靶点”网络体系

图3 复方三黄酊交集靶点基因的PPI网络图

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果 应用Omicshare数据库对35个关键靶点基因的生物过程和代谢通路进行分析，GO功能富集分析得到47条(图4)，其中生物过程为25个(P<0.05)，主要是生物调节、细胞过程、代谢过程、正调节生物过程、刺激反应等，分子功能为8条，主要包括分子结合、分子调节、催化活性、转录活性、分子转录活性等，而细胞组分为14条，主要有细胞器、细胞膜、生物膜内环境、细胞外区等。KEGG信号通路为152条(P<0.05)，取前20条通路做气泡图(图5)，结果主要是富集在癌症通路、人巨细胞病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、MAPK信号通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号通路、癌症蛋白聚糖、IL-17信号通路、TNF信号通路等通路上。因此，可以假设复方三黄酊的抗菌活性可能是通过这些通路发挥作用。

2.6 分子对接验证结果 分子对接技术可研究关键化合物与关键靶点的结合能力，用于验证网络中的关键化合物及靶点。将核心靶点AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF分别与排名前四的关键化合物槲皮素、丁香油酚、β-谷甾醇、药根碱进行分子对接验证。结合能越低，发生作用的可能性越大，一般认为结合能得分<-5.0 kJ·mol-1表明有较好的结合活性[7]。与AKT蛋白结合能力最佳的是β-谷甾醇，与IL-6结合能力最佳的是药根碱，与TP53结合能力最佳的是药根碱，与VEGFA结合能力最佳的是药根碱，与TNF结合能力最佳的是β-谷甾醇(表1，图6)。

图4 复方三黄酊GO功能富集分析图

图5 复方三黄酊KEGG通路富集分析图

表1 复方三黄酊的分子对接结果(kJ·mol-1)

3 讨论

复方三黄酊以黄连、黄芩、黄柏和冰片为主要组方，在抗菌消炎方面疗效显著，可用于治疗各种皮肤感染例如皮肤破溃、痔疮以及烧烫伤等病状。目前体外研究显示，复方三黄酊对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌都有显著的抑菌杀菌作用，尤其是对金黄色葡萄球菌作用较强[8]。由此可见，复方三黄酊可抑制多种致病菌生长，有利于感染性疾病的治疗，促进伤口的愈合。

复方三黄酊包含槲皮素、丁香油酚、β-谷甾醇、药根碱、汉黄芩素、4-羟基肉桂酸、油酸、黄藤素、黄连碱、棕榈酸等362种化合物，其中前10位是靶向性最强的化合物。秦晓蓉等[9]研究表明，槲皮素抗菌谱广，对金黄色葡萄球菌、胶质芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等均有较强的抗菌作用。槲寄生的药理作用广泛，具有抗氧化、抗菌、炎症、病毒、免疫系统调节、抗癌、降糖、心血管保护等作用[10]。丁香油酚可影响细胞膜的通透性，减少病原体对宿主细胞的粘附，降低病原体的致病性。此外，丁香油酚可诱导细胞内的氧化应激，导致细菌和真菌的凋亡[11-12]。Ding等[13]研究发现，在以葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠模型中，肠上皮细胞、巨噬细胞上抗菌肽的表达在β-谷甾醇作用后显著增加，伤寒沙门菌的存活率降低。赵小然等[14]研究发现，β-谷甾醇可与肺炎链球菌溶血素上胆固醇的结合位点结合，从而抑制肺炎链球菌的细胞毒性及基因毒性，具有抗肺炎链球菌感染的作用。此外，β-谷甾醇对金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等也具有较强的抑制作用[15]。总之，复方三黄酊中的槲皮素、丁香油酚、β-谷甾醇等在动物实验和细胞水平上均表现出良好的抗菌作用。

复方三黄酊发挥抗菌作用有35个关键靶点，分值由高到低排序依次为INS、AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF等。AKT被激活后参与介导多种复杂的生物学效应，作为重要信号通路参与调节细胞生长、代谢、增殖和凋亡[16]。而IL-6、TNF-α在诊断细菌感染中具有重要意义[17]。本研究筛选到的靶标基因包括IL及TNF，验证了靶标基因参与抗菌作用。TP53参与到修复DNA、促进细胞凋亡作用等重要过程中，在机体免疫应答及炎症反应中也发挥了一定作用[18]。VEGF是一种特异性较高的炎性因子，其具有促进血管内皮细胞生长，血管通透性增加，血管形成及维持血管发挥正常功能等作用[19]。

从GO功能富集结果看，复方三黄酊的有效成分靶点主要集中在细胞器、细胞膜、细胞内及细胞外，参与生物调节、细胞过程、代谢过程、刺激反应及生物学过程的正调节等过程。通路富集结果看靶点基因显著富集在MAPK信号通路、磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路。转录因子c-Jun、c-Fos被MAPK信号激活后促使TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子转录[20]。MAPK信号通路参与了炎症反应、应激反应以及细胞的生长、分化和凋亡等过程[21]。磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号通路可调节活化炎性反应细胞、释放炎性递质等途径[22]。IL-17A参与调节炎症和免疫反应，该因子在机体抵御细菌和真菌感染中起到重要作用[23]。TNF是一类可对生物体产生多种影响的细胞因子[24]，与细胞膜上的受体结合，促进细胞的生长、分化、凋亡及诱发炎症等，参与抗菌、抗病毒、免疫调节等。以上表明，复方三黄酊抗菌作用可通过多生物途径、多条信号通路共同实现。分子对接结果显示，药根碱与3个关键靶点结合能力均最佳，值得进一步深入探索。本研究中所预测的核心成分与关键靶点之间具有较强的结合能力，证实了网络药理学预测结果的可靠性。

图6 复方三黄酊的分子对接结果

本研究基于网络药理学及分子对接方法探讨了复方三黄酊的抗菌作用机制，结果表明，复方三黄酊发挥抗菌作用是通过多成分、多靶点、多通路。这为复方三黄酊的临床应用提供了基础理论支持，也为中医药抗菌机制研究提供了思路，有利于后续实验研究的深入和临床应用的拓展。