冬前喷施EBR对‘美乐’葡萄枝条生理特性及萌芽的影响

赵芳芳，郭学良，刘 研，汪月宁，殷梦婷，代红军

(宁夏大学 农学院，银川 750021)

随着宁夏葡萄酒业的发展，酿酒葡萄的种植面积逐年扩大，但主产区冬季低温干旱，冻害频繁发生，造成葡萄产量和品质下降，在一定程度上影响和制约着葡萄酒业的发展[1-3]。2,4-表油菜素内酯(2,4-Epibrassinolide,简称EBR)被誉为第六大植物生长调节剂[4]，极低浓度即可提高植物的抗性，如抗旱性、抗寒性和抗毒性[5-6]。酿酒葡萄对低温反应敏感，枝条萌发适温为18～20℃，低于15℃萌芽率显著降低，气温达到-25℃时植株将会死亡[7-8]。因此，寻找简单有效的方法，对缓解酿酒葡萄的受害程度具有重要的应用价值，对解决酿酒葡萄生产有着重要的现实意义。刘良松等[9]研究表明，EBR能有效缓解低温胁迫对华山松幼苗的影响，降低活性氧对其幼苗的伤害，减轻膜脂过氧化程度，提高华山松幼苗的抗寒能力。刘丽杰等[10]研究表明，在低温条件下， EBR能提高小麦叶片中保护酶活性，并通过多种作用机制，增加了小麦对低温的抵抗力。张霓雯等[11]研究了低温胁迫下，喷施EBR能明显减缓黄金香柳叶片生长受抑制程度，显著增加叶片中抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性，同时降低了MDA含量，表明外源应用EBR可通过影响黄金香柳叶片叶绿素含量及促进根系抗氧化系统活性升高，从而増强植株抗低温的能力。近年来，许多学者对EBR在不同作物抗性方面的应用进行了大量研究，但在酿酒葡萄抗寒性方面的应用少有报道。本研究以酿酒葡萄‘美乐’为试材，经不同浓度EBR(0、0.2、0.4、0.6mg/L)喷施处理，随后在低温(5℃、-5℃、-10℃、-20℃)条件下处理，研究其对酿酒葡萄枝条抗寒性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2020年10月在宁夏农垦集团玉泉营农场，国家葡萄产业技术体系栽培生理与调控岗位试验基地中进行(北纬38°12′，东经105°99′，冬季日均气温-11 ℃，绝对低温-24 ℃)，20～ 40 cm处的地温经常达到-5 ℃以下。

1.2 试验设计

供试材料为5 a生欧洲酿酒葡萄‘美乐’。2020年10月3日果实采收后选取长势基本一致的植株3行，每行4组，每组10株标签标记。随机区组设计，重复3次，将各浓度EBR(0、0.2、 0.4、0.6 mg/L，依次标记为CK、T1、T2、T3)喷施于葡萄整株，每组大约喷施10 L左右，以枝条滴水为准，第1次喷施后隔1 d进行第2次喷施处理，共计喷施2次。之后在埋土防寒前采样，各组剪取1 a生枝条30枝，分别从基部起第6节剪取20～30 cm(粗度在0.9～1.1 cm)的枝条，剪取枝条后两端封蜡，用保鲜膜密封后置于冰盒带回实验室。

将埋土之前采集的样本于4 ℃沙藏1个月后，分别置于5 ℃、-5 ℃、-10 ℃、-20 ℃的变温试验箱(型号:BC1300)进行低温处理。降温至设定温度后持续24 h，之后逐步升温至0 ℃，并保持12 h，升降温速率均为4 ℃/1 h。其余枝条避开芽眼切成1～2 mm薄片，测定其相关指标。

1.3 单芽段恢复生长试验

将用不同浓度油菜素内酯和低温处理后的单芽段用蒸馏水冲洗后晾干，插入含有轻型基质的培养盘中，每个处理3盘，每盘10个单芽段。将培养盘置于人工气候培养箱(MGC-100 H)中，白天温度设置为23 ℃，夜间温度15 ℃，湿度为60%～80%，光照度为3 000 lx。培养40 d后观察记录萌芽率，以露绿芽为标准。

1.4 测定指标及方法

电导率采用电导仪法(DDS-307型)测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法，可溶性糖含量采用葱酮比色法，游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法，过氧化物酶活性(POD)采用愈创木酚法[12-13]，超氧化物歧化酶活性(SOD)采用试剂盒法(购自南京建成生物科技有限公司)。扦插培养40 d后调查萌芽率，并按下式计算。

萌芽率=萌发芽总数/扦插芽段总数×100%

1.5 数据分析

采用Excel 2016、SPSS 21.0软件对试验数据进行作图和统计分析。

2 结果与分析

2.1 EBR处理对‘美乐’葡萄枝条相对电导率和MDA含量的影响

在低温胁迫条件下植物细胞膜结构被破坏，致使电解质外渗，电导率增大，因此，电导率越小，耐寒性就越强。由图1可知，各处理葡萄枝条的电导率及MDA均随温度的降低而增加，在 -10 ℃低温处理下，电导率差异显著，其中CK的电导率值最大，为81.77%，T2处理电导率最小，为45.8%；经EBR处理的葡萄枝条相对电导率和MDA增幅也较小，其中T2处理增幅最小，与CK相比增幅分别减少15.3%和51.2%。因此，EBR可以降低葡萄枝条细胞膜的损害程度，减少电解质外渗。

图1 ‘美乐’葡萄枝条中相对电导率和MDA含量Fig.1 Relative conductivity and malondialdehyde content in branches of ‘Merlot’ grape

2.2 EBR处理对‘美乐’葡萄枝条POD和SOD活性的影响

由图2可知，随温度的降低，各处理葡萄枝条的POD活性呈先升后降趋势。随EBR浓度的增加，当温度大于-5 ℃处理时，POD活性呈先升后降趋势，小于-5 ℃时，呈上升趋势。经EBR处理的葡萄枝条POD活性均高于CK，在-5 ℃时达到最大，其中0.4 mg/L处理差异显著，与对照相比增加 48.05%；在-20 ℃时，POD活性有所下降，但经EBR处理的葡萄枝条POD依然高于对照，0.6 mg/L处理差异显著，与对照相比增加61.81%。总的来说，EBR能够提高葡萄枝条的抗氧化能力，减轻膜脂氧化程度，其中浓度为0.4、0.6 mg/L EBR处理效果较好。随着温度的降低，各处理葡萄枝条的SOD活性呈波动趋势，随着EBR浓度的升高，SOD活性呈上升趋势。EBR浓度为0.6 mg/L时，SOD活性最高，与CK差异显著，这说明浓度为0.6 mg/L的EBR有利于提高葡萄枝条的SOD活性。温度在-20 ℃时，SOD活性增幅最大，说明EBR在-20 ℃时，对葡萄枝条SOD活性的影响最大。

图2 ‘美乐’葡萄枝条中POD和SOD活性Fig.2 Activity of POD and SOD in branches of ‘Merlot’ grape

2.3 EBR处理对‘美乐’葡萄枝条渗透调节物质的影响

从图3可以看出，随着温度的降低，葡萄枝条脯氨酸含量呈先升后降的变化趋势，但整体趋势较为平稳，除T1处理外，其余处理均高于对照。-10 ℃处理时，T2处理的脯氨酸含量最高，与CK相比增加8.65%；当EBR浓度低于0.4 mg/L时，脯氨酸含量与CK接近，差异不显著 (P>0.05)，说明浓度低于0.4 mg/L的EBR对提高葡萄枝条在低温条件下的脯氨酸含量作用小。随着温度的降低，除T2处理外，各处理葡萄枝条的可溶性糖呈下降趋势；随着EBR浓度的增加，呈先升后降趋势，经EBR处理的葡萄枝条可溶性糖含量均高于CK。不同浓度EBR在5 ℃时各处理间差异不显著，在-20 ℃条件下增幅最大，T2处理与CK相比增加46.96%；说明在低温条件下EBR可以促进可溶性糖的积累来保持渗透压平衡，减少水分散失，避免植物因过量脱水死亡。

图3 ‘美乐’葡萄枝条中渗透调节物质Fig.3 Osmotic adjustment substances in branches of ‘Merlot’ grape

2.4 EBR处理对‘美乐’葡萄枝条萌芽率的影响

由表1可知，通过对低温胁迫后，各处理葡萄枝条进行可恢复生长试验，得出各处理枝条在 5 ℃处理时生长势较好，低温胁迫后的萌芽率为60%以上；-5 ℃时，各处理萌芽率都有所降低，0.4 mg/L与对照相比增加了24.05%；-10 ℃，除了对照其余均高于60%以上，0.4 mg/L与对照相比增加了48.07%。在-20 ℃时，各处理萌芽率差异显著，其中0.4 mg/L处理萌芽率最高，与对照相比增加了77.87%。这说明，EBR能够提高低温胁迫时葡萄枝条的萌芽率，且不同浓度对其影响不同，差异显著，其中0.4 mg/L处理相对较好。

表1 ‘美乐’葡萄枝条的萌芽率Table 1 Germination rate of branches of ‘Merlot’ grape %

2.5 葡萄枝条抗寒指标主成分分析

对不同浓度EBR处理的葡萄枝条中6种抗寒指标进行主成分分析，前2个主成分累积贡献率达到提取要求80%以上的要求，为80.446%，可以代表6种抗寒指标的绝大部分信息。从表2可知，第一主成分的特征值为3.128，贡献率为52.125%，主要反映低温胁迫下EBR对葡萄枝条中电导率、MDA的影响；第二主成分的特征值为1.699，贡献率为28.321%，主要反映低温胁迫下EBR对葡萄枝条中POD、SOD、脯氨酸的影响，因此抗氧化酶可作为第二主成分。

表2 主成分分析Table 2 Principal component analysis

3 讨 论

3.1 EBR处理对‘美乐’葡萄枝条萌芽率的影响

低温胁迫将会导致植物萌芽延迟、生长发育受阻，生长量增加迟缓，胁迫严重时生长完全停止[14]。有研究发现，喷施EBR对烟草萌芽有显著促进作用，随处理浓度升高，促进作用增强[15]。也有研究表明，适宜浓度的EBR能有效缓解低温胁迫对水稻萌芽的影响[16]。本研究发现，随低温胁迫程度的增加，各处理萌芽率都有所降低，但经EBR处理的葡萄枝条萌芽率随温度的减低降幅较小，0.4 mg/L处理的EBR能够显著提高葡萄枝条的萌芽率。这与前人研究结果一致[15-16]。

3.2 EBR处理对‘美乐’葡萄枝条生理指标的影响

植物受到低温胁迫时，细胞内活性氧大量积累，使其代谢失衡，导致膜脂过氧化产生丙二醛(MDA)，最终造成细胞膜系统氧化损伤，细胞内的离子外渗，细胞的相对电导率增大[17-18]。此时，植物体内抗氧化防御系统活性增加，防止细胞内过量积累的活性氧对植物造成的氧化伤害。SOD作为植物细胞的第一道抗氧化防线，能将超氧阴离子自由基转化为过氧化氢。POD能将过氧化氢(H2O2)分解，从而缓解了由于活性氧积累对细胞带来的伤害[19-20]。本研究发现低温胁迫后，经 0.4 mg/L处理的葡萄枝条的电导率和MDA含量最低，适当浓度的EBR可以降低MDA含量和减少离子外渗，这与小麦和甘薯等其他作物上的研究结果一致[21]。本研究还发现，低温胁迫时，0.4 mg/L和0.6 mg/L的EBR使得SOD活性都显著增强，EBR浓度为0.4 mg/L时达到峰值，这与杨莲等[22]对番茄的研究基本一致，0.2 mg/L的SOD活性虽然也增强，但不显著。这说明一定浓度的EBR能显著提高葡萄枝条POD活性，从而降低氧自由基含量，清除过多的活性氧，从而减轻膜脂过氧化程度，进而增强葡萄枝条的抗寒性。这与张爱敏等[23]在低温胁迫下BR处理能提高黄瓜POD活性以及吴旺嫔等[24]对低温胁迫下EBR处理可使水稻种子的POD活性显著增强的研究结果一致。

低温胁迫下植物细胞内正常的代谢活动会发生改变，细胞内会积累一些渗透调物质来维持细胞膨压对一些生理功能的调控，从而缓解逆境胁迫给植物带来的伤害[9]。本研究中EBR促进了枝条对可溶性糖和脯氨酸的积累，可溶性糖在 0.4 mg/L处理中积累得最多，而EBR对脯氨酸积累则不显著，这说明葡萄枝条在受到低温胁迫时，通过提高自身可溶性糖含量来增强抵抗低温的能力，这与其他学者在作物[25-26]中的研究结果一致。植物在受到低温胁迫时EBR可调控葡萄植株积累较多的可溶性糖等渗透调节物质，这些可溶性糖可防止细胞脱水，降低冰点，从而减轻低温伤害。

4 结 论

EBR提高了葡萄枝条的抗氧化能力和渗透调节物质的含量，减少了质膜受损程度，提高了葡萄枝条的抗寒性，其中0.4 mg/L表现最优。