响应面法优化辣木叶蛋白提取工艺及凝集活性研究

杨 豪，刘晓雪，苏海冉，李凌飞，宋 爽

（云南农业大学食品科学技术学院，国家辣木加工技术研发专业中心，云南昆明 650201）

辣木（Moringa oleifera）也被称为油辣木或鼓槌树，具有明显辛辣味[1]。我国已引进印度传统辣木、印度改良辣木和非洲辣木。辣木成熟快，产量高，适应性强，广泛种植在亚洲和非洲热带和亚热带地区，在我国的海南、四川、广东、广西和云南等多地都有种植。辣木营养丰富，其叶片资源最丰富，采集最方便，发育最早，研究最多[2]。

辣木叶在一些国家被广泛用作基本食物，并于2012年被我国卫生部批准认定为新资源食品，辣木也被列为我国药食两用的植物，是具有发展前景的新资源[3]。辣木叶含有丰富的营养物质如蛋白质、纤维素、维生素、矿物质等，其含有的抗营养成分较少，能有效地抵抗营养不良[4]。研究表明，辣木蛋白质含量（鲜叶约6%，干叶约27%）是牛奶的4倍，氨基酸总量达到20.49%，并含有11种人体无法自行合成或合成速率不能满足自身需要的必需氨基酸[5]，2009年Di等[6]完善了辣木叶常规营养成分测定，含量最高的三种氨基酸分别为谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸。蛋白提取最常见的方法有碱溶酸沉法、超滤法、加热法、盐析法等，其最传统的方法为碱溶酸沉法[7]，但对于辣木叶，经预试验发现碱溶酸沉法的蛋白提取需要消耗大量的酸和碱，因为辣木叶水溶液的pH较低（pH5.3～5.5），调pH的过程需要消耗大量的酸和盐，且成本较高。超滤法一般是在常温状态下，通过调节泵的压力和流量对溶液中的物质进行选择性分离，其具有操作简便、能量消耗小等优点[8]。加热法主要为直接加热法，即直接对浸提溶液进行加热，蛋白受热沉淀后通过离心可得粗蛋白，但是温度过高会破坏蛋白结构使其变性，蛋白活性降低的同时其得率也会有所降低。盐析法是利用蛋白在一定浓度的盐溶液中沉淀析出的特性来分离纯化植物叶蛋白。该方法具有操作简单、成本低且叶蛋白活性高等优点。

凝集素（lectin）是一种从植物或者动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，其可逆结合专一性单糖或寡糖，能凝集红血球[9]。研究发现辣木蛋白具有较强的净化水、抗炎、抗菌、抗癌等生物活性。PRITCHARD等[10]研究发现辣木蛋白可以去除水中84%的浊度和88%的大肠杆菌。康丹丹等[11]研究发现辣木叶蛋白可以抑制金黄色葡萄球菌的活性。COELHO等[12]研究发现辣木凝集素对芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、铜绿假单胞菌均有杀菌作用。LUCIANA等[13]研究发现辣木凝集素能使B16-F10黑色素瘤细胞的活力降低并导致其死亡。本文以新鲜辣木叶为原料，以蛋白得率为指标，盐析法提取蛋白，响应面优化辣木叶蛋白提取工艺，并研究辣木叶蛋白的凝集效价及其专一性抑制糖，旨在探索一种增加蛋白得率的方法，为云南辣木产业发展及辣木蛋白开发利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜辣木叶 德宏天佑科技开发有限公司；牛血清蛋白 Sigma公司；硫酸铵 天津化学试剂有限公司；PBS缓冲液冻干分、ɑ-甲基-D-吡喃葡萄糖苷、麦芽糖-水合物、D-甘露糖、D（+）无水葡萄糖、D-棉子糖五水物、甲基-ɑ-D-吡喃葡萄糖苷、乳糖、甲基-β-D-吡喃半乳糖苷 北京索莱宝科技有限公司。

AR224CN型电子天平 奥豪斯仪器（常州） 有限公司；TDL-5-A型离心机 上海安亭科学仪器厂；FD-1A-50型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；酶标仪 赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 辣木叶蛋白提取的工艺 称10 g新鲜辣木叶加入PBS（磷酸缓冲盐溶液），用榨汁机将辣木叶打碎，将辣木叶汁放进4 ℃冰箱中静置，取出后用纱布过滤弃滤渣，将辣木叶汁在离心机中3500 r/min，离心20 min，去除残渣留上清液，硫酸铵试剂加到上清液中搅拌均匀并静置，在离心机中3500 r/min，离心20 min，去除上清液留沉淀，用PBS溶解沉淀，溶液装入透析袋中，将透析袋放到装有超纯水的桶中，在磁力搅拌器作用下加快除盐的速度，直至硫酸铵被去除干净，在冷冻干燥机中进行冷冻干燥（-50 ℃）[14-15]。

1.2.2 单因素实验 按照工艺流程，考察提取时间、硫酸铵饱和度、料液比三个因素对辣木叶蛋白得率的影响，确定最佳工艺的因素水平。

1.2.2.1 提取时间对辣木叶蛋白得率的影响 在硫酸铵饱和度为70%，料液比为1:8 g/mL的提取条件下，考察不同提取时间（2、4、6、8、10 h）对辣木叶蛋白得率的影响。

1.2.2.2 硫酸铵饱和度对辣木叶蛋白得率的影响在提取时间为8 h，料液比为1:8 g/mL的提取条件下，考察不同硫酸铵饱和度（50%、60%、70%、80%、90%）对辣木叶蛋白得率的影响。

1.2.2.3 料液比对辣木叶蛋白得率的影响 在提取时间为8 h，硫酸铵饱和度为70%的提取条件下，考察不同料液比（1:2、1:4、1:6、1:8、1:10 g/mL）对辣木叶蛋白得率的影响。

1.2.3 辣木叶蛋白提取工艺响应面试验设计 根据单因素实验所确定的各因素对辣木叶蛋白得率的影响，利用响应面Box Behnken试验设计，选择提取时间、硫酸铵饱和度、料液比3个因素，各取3个水平进行试验设计，以辣木叶蛋白得率为响应值，并对结果进行合理分析并认证，以确定辣木叶蛋白提取的最佳工艺。响应面分析因素及水平见表1。

表1 响应面因素及水平设计Table 1 Response surface factors and levels

1.2.4 辣木叶蛋白含量的测定 参照代佳和等[16]和黄秋伟等[17]的方法并稍作修改，用BCA法测定蛋白质浓度，以牛血清蛋白作为标准蛋白，在波长595 nm处测吸光值，制作标准曲线，回归方程为y=1.8291x-0.01，R2=0.997，其中y为蛋白浓度，x为吸光值。以溶液中蛋白得率作为参考依据确定各工艺的最佳条件。

式中：C为标准曲线算出的蛋白质质量浓度，mg/mL；V为辣木叶提取液的体积，mL；N为辣木叶提取液稀释倍数；M为新鲜辣木叶的质量，g。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE SDS-PAGE：参照闻崇炜等[18]、施娅楠等[19]的方法：第一个程序50 V，30 min；第二个程序 120 V，70 min。

考马斯亮蓝染色：将胶取下，放入固定液中，在摇床上摇晃使其固定30 min左右，倒入适量的考马斯亮蓝染液，并避光过夜染色，回收考马斯亮蓝染液，倒入干净的脱色液，直至胶的背景干净，用UP水浸泡，置于凝胶快速成像仪进行拍照。

1.2.6 辣木蛋白凝集活性的测定 取96孔V型血凝板，用移液枪依次向各孔中加入50 μL PBS，第一个孔加入50 μL 1 mg/mL辣木叶蛋白提取液，进行吸打4～5次，混合均匀后，从第一孔吸出50 μL，移至第二个孔中再次吹打4～5次，混合后再吸出50 μL，移至第三孔，以此类推作倍比稀释（每排的最后一个孔不加，用作空白对照），然后向每个孔中加入50 μL 4%的兔红细胞悬液[20]，并将V型血凝板放在微型振荡器上振荡1 min使充分混匀，在室温放置2 h后肉眼观察血凝结果，用2n（n为孔的位数）表示[21]。

1.2.7 辣木叶蛋白糖抑制/结合特异性 将八种糖配制成0.5 mol/L的糖溶液，用移液枪吸取50 μL糖溶液在96孔“V”型血凝板第一个孔中，第二到第九个孔加入相同剂量，pH含量为7.4，用PBS等倍稀释糖溶液，第十个孔用PBS做对照。每孔中都加50 μL的辣木叶蛋白，混匀后，并将V型血凝板放在微型振荡器上振荡1 min使充分混匀，室温静置30 min，再加入50 μL的4%兔红细胞悬液，室温静置2 h后，检测凝血活力。实验中用到糖的种类分别是：ɑ-甲基-D-吡喃葡萄糖苷、麦芽糖-水合物、D-甘露糖、D（+）无水葡萄糖、D-棉子糖五水物、甲基-ɑ-D-吡喃葡萄糖苷、乳糖、甲基-β-D-吡喃半乳糖苷[22]。

1.3 数据处理

使用Design-Expert 8.0.6进行响应面设计，实验结果用 GranphPad Prism5软件进行统计分析并作图。其中P＜0.05说明差异显著，P＜0.01说明差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取时间对辣木叶蛋白得率的影响 在硫酸铵饱和度为70%，料液比为1:8 g/mL的条件下，提取时间对辣木叶蛋白得率的影响如图1所示。辣木叶蛋白的得率随着提取时间的增加而增加；当时间增加到8 h时，蛋白得率随之降低，可能是因为随着时间的延长细胞内的蛋白降解酶也随之溶出，这些蛋白降解酶降解了部分溶出的蛋白，从而降低了蛋白的得率[23]。提取时间在8 h时，辣木叶蛋白提取效果最好，得率为10.08 mg/g，是提取时间2 h的蛋白得率的0.55倍。因此，确定提取辣木叶蛋白的最佳时间为8 h。

图1 提取时间对辣木叶蛋白得率的影响Fig.1 Effects of extraction time on the yield of Moringa oleifera leaf protein

2.1.2 硫酸铵饱和度对辣木叶蛋白得率的影响 在提取时间为8 h，料液比为1:8 g/mL的条件下，硫酸铵饱和度对辣木叶蛋白得率的影响如图2所示。当硫酸铵饱和度从50%增加到70%时，辣木叶蛋白的得率从6.66 mg/g增加到12.09 mg/g。然而继续增大硫酸铵的饱和度至90%时，辣木叶蛋白得率比70%显著（P＜0.05）降低了0.67倍，这可能是蛋白质在高浓度盐溶液环境下发生了盐析，从而降低了辣木叶蛋白得率[24]。因此，确定提取辣木叶蛋白的最佳硫酸铵饱和度为70%。

图2 硫酸铵饱和度对辣木叶蛋白得率的影响Fig.2 Effect of ammonium sulfate saturation on yield of Moringa oleifera leaf protein

2.1.3 料液比对辣木叶蛋白得率的影响 在提取时间为8 h，硫酸铵饱和度为70%的条件下，料液比对辣木叶蛋白得率的影响如图3所示。当液料比从1:2 g/mL增大到1:6 g/mL时，辣木叶蛋白得率从7.42 mg/g增加到12.54 mg/g，蛋白得率快速提高可能是由于溶剂的适量增加使得辣木也在溶剂中的接触面积与分散度增大，扩散作用增强[25]。随着料液比的增加辣木叶蛋白得率却降低，说明当可溶性蛋白浓度达最大值后，料液比的增加反而会使蛋白质浓度降低[26]，因此确定提取辣木叶蛋白的最佳料液比为1:6 g/mL。

图3 料液比对辣木叶蛋白得率的影响Fig.3 Effects of material-to-liquid ratio on the yield of Moringa oleifera leaf protein

2.2 响应面优化辣木叶蛋白提取的优化

2.2.1 响应面试验设计结果 在单因素实验基础上，根据3因素3水平进行二次中心组合试验设计，测定17组实验的蛋白得率，结果如表2所示。

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

2.2.2 模型建立及显著性检验 利用Design-Expert 8.06软件对表3进行回归拟合，得到的提取时间、硫酸铵饱和度、料液比3个因素的二次方程模型为：

蛋白得率（mg/g）=13.14-1.68A+0.15B+0.021C-0.57AB-2.72AC+0.39BC-2.19A2-3.04B2-1.93C2

回归模型模型方差分析结果见表3。

采用方差分析对辣木叶蛋白得率进行显著性检验分析。由表3、表4可知：模型F=44.69、P＜0.01，说明该模型是极显著的；失拟项型P=0.4543＞0.05，模型失拟不显著，说明实验误差主要来源于随机误差，未知因素对实验结果影响较小。模型的决定系数R2=0.9829，调整系数R2（adj）=0.9609，说明模型能解释96.09%响应值的变化，信噪比（Adeq Precision=19.611）大于4，因而拟合度和可信度较好[27]，可用模型对辣木叶蛋白得率进行分析和预测。CV值（Y的变异系数）表示实验准确度，CV值越小，试验的可靠性越高，本实验的CV值为5.98%，说明试验可靠性较高，具有一定实践指导意义。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Regression model variance analysis table

2.2.3 响应面分析结果 图4是通过二次回归模型拟合的各因素之间交互作用的响应面分析图。当响应面图的曲面越陡峭，两两因素的交互作用就越明显，相反，当响应面图的曲面越平缓，两两因素的交互作用就越不显著。当等高线呈圆形时表示两因素交互作用不显著，而椭圆形或马鞍形时则表示两因素交互作用显著[28]。由图5可知，各图均开口向下，凸形曲面，都存在极值。交互项AB、BC对响应值影响不显著（P＞0.05），AC 对响应值影响（P＜0.01）极显著。由图5a可知，提取时间对辣木叶蛋白得率的影响大于硫酸铵饱和度；由图5b可知，提取时间对辣木叶蛋白得率的影响大于料液比；由图5c可知，硫酸铵饱和度对辣木叶蛋白得率的影响大于料液比；由图5可知，等高线形状趋近于椭圆形，说明两两因素交互作用明显。因此，各因素影响辣木叶蛋白得率的影响依次为A（提取时间）＞B（硫酸铵饱和度）＞C（料液比），其结果与方差分析结果相同，证明了该模型可靠性高。

图4 各两因素交互影响蛋白得率的响应面图Fig.4 Response surface diagram of the interaction of two factors affecting protein yield

2.2.4 最佳工艺条件的确定及验证试验 通过回归模型优化得出的辣木叶蛋白得率的最佳工艺条件分别是提取时间6.55 h，硫酸铵饱和度71.27%，料液比1:9.06。为验证该模型的预测是否准确，并考虑实际操作过程中的方便性，对实验条件稍作调整，确定的最佳工艺条件为提取时间7 h、硫酸铵饱和度71%、料液比1:9，试验测得辣木叶蛋白得率为13.49 mg/g，与预测结果13.76 mg/g基本相符，说明运用响应面优化得到的模型参数准确可靠，具有实际应用价值。

2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE

辣木叶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱见图5，由图5可知，辣木叶蛋白的分子量主要集中在100～55 kDa（a）、35～25 kDa（b）、25～15 kDa（c）以及10 kDa（d）四个区域。

图5 蛋白标品和辣木叶蛋白电泳图Fig.5 Protein standard and Moringa oleifera leaf protein electrophoresis diagram

2.4 辣木叶蛋白凝集活性的测定

辣木叶蛋白凝集活性与兔红细胞凝集素效应的比较见图6和表4，结果表明，辣木粗提蛋白可凝集兔血红细胞，并得出辣木叶蛋白的凝集效价为28。赵则海等[29]用氯化钠提取四棱豆叶的蛋白并发现其凝血效价为25。从玉婷等[30]用生理盐水提取六种海藻蛋白，发现角叉菜凝血效价为20，松节藻凝血效价为20，海带凝血效价为213，裙带菜凝血效价为25，条斑紫菜凝血效价为24，萱藻凝血效价为22。

表4 兔红细胞凝集素效应的比较Table 4 Comparison of rabbit hemagglutinin effects

图6 兔红细胞凝集素效应图Fig.6 Effect of rabbit hemagglutinin

2.5 辣木叶蛋白的糖抑制/结合特异性

8种糖对辣木叶蛋白的抑制作用见表5，ɑ-甲基-D-吡喃葡萄糖苷的凝血效价为22，麦芽糖-水合物的凝血效价为 22，D-甘露糖的凝血效价为 23，D（+）无水葡萄糖的凝血效价为20，D-棉子糖五水物的凝血效价为24，甲基-ɑ-D-吡喃葡萄糖苷的凝血效价为23，乳糖的凝血效价为22，甲基-β-D-吡喃半乳糖苷的凝血效价为24。在半抗原抑制的反应状态下，抑制效果最优的糖称为凝集素的专一性糖。经过实验得出，D（+）无水葡萄糖是辣木叶蛋白凝集素专一性抑制糖，可以较好地抑制兔红细胞和辣木叶蛋白凝集反应，ɑ-甲基-D-吡喃葡萄糖苷、乳糖、麦芽糖-水合物对凝血反应也有部分抑制作用。

表5 辣木叶蛋白糖抑制/结合特异性Table 5 Moringa leaf protein sugar inhibition/binding specificity

3 结论

本实验以新鲜辣木叶为原料，在单因素实验基础上，结合响应面法建立盐析法制备辣木叶蛋白工艺的回归模型，所得到的模型显著，回归方程拟合度较好。并通过对回归方程的分析解决多变量问题，寻找最佳提取工艺，经分析各因素对辣木叶蛋白得率的影响顺序为：提取时间＞硫酸铵饱和度＞料液比，确定的最佳工艺条件为提取时间7 h、硫酸铵饱和度71%、料液比1:9，在此条件下辣木叶蛋白得率为13.49 mg/g，与预测结果13.76 mg/g基本相符。经聚丙烯酰胺凝胶电泳图，可知辣木叶蛋白的分子量主要集中在 100～55、35～25、25～15以及 10 kDa四个区域。辣木叶蛋白的凝集效价为28，D（+）无水葡萄糖是辣木凝集素专一性抑制糖，可以较好地抑制兔红细胞和辣木叶蛋白凝集反应。本试验通过盐析法一定程度上提高了蛋白得率，但与粗蛋白总量相比还有很大的开发空间，采用新技术提高辣木叶中蛋白得率有待进一步研究。