响应面法优化红景天多酚提取工艺及其体外α-葡萄糖苷酶抑制活性

任卫合，罗龙龙，王丽萍，高彩雯，余金凤，皮尔·穆罕默德·阿卜杜勒，丁功涛，陈士恩

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730124；2.西北民族大学生物研究中心，中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃兰州 730124；3.马来西亚国立大学工程与建筑环境学院，雪兰莪邦吉 43600）

II型糖尿病（T2DM）是一种全球流行的代谢和内分泌失调疾病，占所有糖尿病患者95%左右[1]，长期高血糖易损伤血管和神经，诱发多种疾病。T2DM的餐后血糖升高主要是由于摄入的碳水化合物被小肠刷状缘绒毛膜上皮细胞的α-葡萄糖苷酶分解成易于被人体吸收的葡萄糖而导致[2]。α-葡萄糖苷酶抑制剂可通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，减弱或减缓葡萄糖在肠道中的吸收[3]，改善餐后高血糖。目前，T2DM主要治疗途径是通过阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制剂控制餐后血糖水平，然而此类药物为人工合成，长期服用将引起胀气、腹部不适等不良反应，还有可能产生药物耐药性[4]及毒副作用。因此寻找一种天然、安全、高效、温和、不良反应少的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有重要意义。研究表明，凤凰单枞多酚[5]、槟榔多酚提取物[6]均存在一定体外α-葡萄糖苷酶抑制作用。

红景天（Rhodiola rosea）为景天科景天属多年生草本植物，是一种药食同源性药材，在我国主要分布于吉林、西藏、新疆及云南西北部等高海拔或极高海拔地区。红景天富含多酚、多糖等天然活性物质[7-8]，这些物质是其发挥各种活性功能的基础，使其具有抗缺氧、抗疲劳[9]、抗肿瘤[10]、降血脂[11]、降血糖[12]等多种药理作用。

目前国内外对红景天多酚的研究主要集中于提取工艺优化、分离纯化、含量测定、抗氧化等方面[13-17]，关于红景天多酚对α-葡萄糖苷酶活性抑制方面研究较少。其提取方法有超临界二氧化碳萃取法[15]、低共溶剂提取[13]、有机溶剂萃取等，但均存在操作繁琐、成本较高等劣势，与其他的提取技术相比，超声波辅助提取法具备价格低廉、高速快捷、所需温度低等特点，因此本研究采用超声辅助乙醇提法提取红景天多酚，探究乙醇浓度、料液比、超声功率、超声温度以及超声提取时间对红景天多酚提取的影响，通过单因素及Box-Behnken响应面实验优化提取工艺，并构建体外α-葡萄糖苷酶抑制体系，研究红景天多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，同时通过酶抑制动力学，判断其抑制类型，研究旨为天然降血糖物质开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红景天 大花红景天（Rhodiola crenulata（HK.f.et Thoms.） H.Ohba），采自西藏昌都，由西北民族大学陈士恩教授鉴定；α-葡萄糖苷酶 Sigma公司；没食子酸标准品 Solarbio公司；无水乙醇、无水碳酸钠、氢氧化钠 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；福林酚 大连美伦生物有限公司；磷酸二氢钠 上海广诺化学科技有限公司；96孔板 康宁生命科学有限有限公司。

QE-200型高速万能粉碎机 浙江屹立工贸有限公司；X1R型高速冷冻离心机、1510型酶标仪美国赛默飞世尔科技公司；LGJ-20F型真空冷冻干燥机 日本松源华兴科技有限公司；DL-1500Y型超声波提取仪 中科都菱公司；L8型紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红景天多酚提取 采用超声辅助乙醇提法对红景天多酚进行提取。红景天根、茎置于鼓风干燥箱中80 ℃烘干至恒重，粉碎后过50目筛，密封避光保存备用。取1 g红景天粉末，按料液比加入一定体积分数乙醇溶液，后在一定超声功率、超声温度、超声时间下进行提取，将所得提取固体与液体10000 r/min离心10 min，上清液即为红景天多酚提取液，提取3次。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 乙醇浓度对多酚得率的影响 在料液比1:30 g/mL，温度55 ℃、超声功率270 W条件下，按1.2.1中提取流程，分别利用体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇超声提取30 min，探究乙醇浓度对红景天多酚得率的影响。

1.2.2.2 超声温度对多酚得率的影响 将浓度为70%的乙醇用作提取溶剂，在料液比1:30 g/mL、超声功率270 W条件下，按1.2.1中提取流程，设置温度为 35、45、55、65、75 ℃，超声提取 30 min，探究超声温度对红景天多酚得率的影响。

1.2.2.3 料液比对多酚得率的影响 将浓度为70%的乙醇用作提取溶剂，在温度55 ℃、超声功率270 W条件下，按1.2.1中提取流程，分别采用料液比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL的比例超声提取30 min，探究料液比对红景天多酚得率的影响。

1.2.2.4 超声功率对多酚得率的影响 将浓度为60%的乙醇用作提取溶剂，在料液比1:30 g/mL、温度55 ℃条件下，超声功率分别设为150、210、270、330、390 W，超声提取30 min，探究超声功率对红景天多酚得率的影响。

1.2.2.5 提取时间对多酚得率的影响 将浓度为60%的乙醇用作提取溶剂，在料液比1:40 g/mL、温度55 ℃、超声功率150 W条件下，按1.2.1中提取流程，分别超声 10、20、30、40、50 min，探究提取时间对红景天多酚得率的影响。

1.2.3 响应面试验 依据单因素实验结果，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、超声功率（C）和超声温度（D）为影响因素，以提取得率为响应值，采用4因素3水平分析方法，利用Design-Expert 8.0.6 软件进行Box-Behnken 实验设计，优化红景天多酚提取工艺，设计见表1。

表1 Box-Behnken 试验设计因素与水平Table 1 Box-Behnken experimental design factors and levels

1.2.4 红景天多酚含量测定

1.2.4.1 没食子酸标准曲线绘制 配制浓度为2、4、6、8、10、12 μg/mL 没食子酸标准溶液，分别精密量取各标准溶液20 μL置于10 mL棕色容量瓶中，加入蒸馏水3 mL，福林酚0.5 mL，摇匀，放置在避光处3 min，加入浓度7.5 mg/mL碳酸钠溶液1.5 mL，加蒸馏水稀释至刻度，于760 nm处进行比色测定吸光值A，重复3次，得回归方程：y=0.0324x+0.0114（R2=0.9997）。

1.2.4.2 多酚含量测定 采用福林-酚比色法[18]进行红景天多酚含量测定。红景天多酚提取液按1.2.4.1所述方法处理后测定吸光值，由标准曲线回归方程得红景天多酚浓度，后按下式计算多酚得率：

式中：C为红景天多酚提取液稀释后浓度，μg/mL；V为提取液稀释后体积，mL；m为样品质量，g；n为稀释倍数。

1.2.5 红景天多酚体外α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 以最优条件进行红景天多酚提取，将提取液旋转蒸发浓缩体积至1/3，然后冷冻干燥得多酚提取物，并配置成不同浓度样品溶液备用。参考Usman的方法[19]，并加以修改，测定其体外α-葡萄糖苷酶抑制活性，取 10 μL 样品溶液与 45 μL 5 U/mLα-葡萄糖苷酶磷酸盐溶液（0.2 mol/L，pH5.0），振荡混匀后置于54 ℃培养箱，使其反应 10 min。然后加入35 μL 5 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）溶液启动反应，并置于54 ℃培养箱孵育30 min，加入100 μL溶液（0.2 mol/L）终止反应，于 405 nm处测定其吸光值。以PBS溶液替代α-葡萄糖苷酶溶液测定样品空白；以PBS替代样品测定酶液空白。并按照下列公式计算抑制率：

式中：AC为未添加样品反应液的吸光值；为酶液空白吸光值；AS为添加样品反应液的吸光值；为样品空白吸光值。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制动力学测定 以酶浓度为横坐标，酶促反应初速率V（ΔA/min）为纵坐标作图，以判断其是否为可逆抑制；以底物浓度的倒数（1/[s]）为横坐标，反应初速率的倒数（1/V）为纵坐标，得Lineweaver-Burk双倒数曲线，判断其抑制类型。

1.3 数据处理

所有试验平行测定3次，采用Microsoft Excel 2010、Origin 2018、SPSS 21进行数据处理、分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对多酚得率的影响 由图1可知，随着乙醇浓度增大，多酚得率逐渐增大，这种结果可能是由于含有一定体积水的溶剂有利于提取溶剂润湿提取物，使溶剂极性、水溶性增大而导致的，乙醇浓度增至70%时，多酚得率达最大值。但当乙醇浓度继续增大后多酚得率却降低，这是由于红景天中多酚氢键和疏水键破坏，不利于在组织内提取出所致[20]。因此选取乙醇浓度为60%、70%、80%为响应面分析的3个水平。

图1 乙醇浓度对红景天多酚得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of Rhodiola rosea polyphenols

2.1.2 超声温度对多酚得率的影响 由图2可知，在35～55 ℃之间，随温度升高，红景天多酚得率明显增加，于55 ℃时达最大值，超声温度继续升高，得率反而降低，因此，最佳提取温度为55 ℃。造成这种现象的原因可能是多酚类物质对热极不稳定，温度过高会致使多酚物质被破坏[14]，这与蓝莓[21]、凤凰单枞[5]、嘉宝果叶[22]等多种植物多酚的提取研究结果较为一致，均需在较为温和温度下进行。因此，选取超声温度45、55、65 ℃为响应面设计的3个水平。

图2 超声温度对红景天多酚得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Rhodiola rosea polyphenols

2.1.3 料液比对多酚得率的影响 由图3可知，随溶剂比例增加，红景天多酚得率逐渐升高，当料液比为1:40时，多酚得率达最大值，继续增加溶剂量，得率反而下降，这可能因为溶剂体积过大，其他物质从组织中断裂和扩散出来所致。因此，料液比设置1:30、1:40、1:50 g/mL为响应面设计3个水平。

图3 料液比对红景天多酚得率的影响Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of Rhodiola rosea polyphenols

2.1.4 超声功率对多酚得率的影响 由图4可知，随超声功率增加，多酚得率先升高后降低，达330 W时得率最高，当功率继续增加，得率反而降低，这种现象可能是随着超声功率增加，产生的气泡越来越明显，使散射衰减增加，进而形成声屏障所导致[23]。因此功率为330 W时，提取效果最佳。设置270、330、390 W为响应面3个水平。

图4 超声功率对红景天多酚得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of Rhodiola rosea polyphenols

2.1.5 提取时间对多酚得率的影响 提取时间对多酚得率的影响结果如图5所示，提取时间在10～30 min内，多酚得率明显增大，超声30 min后，多酚得率变化不大，且超声30与40、50 min处理，多酚得率差异不明显，因此为节约时间成本，选取最佳提取时间为30 min，并不进行响应面优化。

图5 提取时间对红景天多酚得率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the yield of Rhodiola rosea polyphenols

2.2 响应面试验结果

响应面设计及结果见表2，采用Design expert 8.0软件对表2中试验结果进行多项拟合回归，得到红景天多酚得率Y对乙醇浓度（A）、料液比（B）、超声功率（C）和超声温度（D）的二次多项回归模型方程：Y=11.38+0.60A+0.058B-0.58C+0.27D+0.64AB+0.90AC-0.15AD-0.12BC-0.075BD-0.51CD-1.67A2-1.86B2-1.61C2-2.87D2

表2 响应面设计及结果Table 2 Response surface design and results

为检验回归方程有效性并确定各因素对红景天多酚得率影响程度，对回归模型进行方差分析，结果见表3和图6。所建立方程模型极显著相关（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明该模型方程与实际拟合度较好。决定系数R2=0.9768，调整决定系数R2Adj=0.9537，变异系数CV值为4.85%，表明模型离散程度小。一次项中乙醇浓度与超声功率对多酚得率存在极显著影响（P＜0.01），超声温度存在显著影响（P＜0.05）；二次项中乙醇浓度、料液比、超声功率和超声温度均对多酚得率曲面效应影响极显著（P＜0.01）；交互项中，乙醇浓度和料液比、乙醇浓度和超声功率对多酚得率具有极显著影响（P＜0.01），超声功率和超声温度对多酚得率存在显著影响（P＜0.05）。根据F值可得，各因素影响主次顺序为乙醇浓度（A）＞超声功率（C）＞超声温度（D）＞料液比（B）。

图6 不同条件对提取得率的交互影响Fig.6 Interaction of different conditions on the extraction rate

表3 回归方程系数显著性检验和方差分析Table 3 Regression equation coefficient significance test and analysis of variance

优化后得出最佳提取条件为：乙醇浓度71.45%、料液比1:40.44 g/mL、超声功率321.07 W、超声温度55.55 ℃，考虑到实际操作限制，将提取条件调整为：乙醇浓度71%、料液比1:40 g/mL、超声功率320 W、超声温度55 ℃，在此条件下进行验证试验，红景天多酚得率可达11.45%。与理论预测值基本一致，表明本响应面试验所得回归模型具有较好准确性。

2.3 红景天多酚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

红景天多酚对α-葡萄糖苷酶活性抑制效果如图7所示，结果表明，红景天多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，且抑制能力随红景天多酚浓度增大而增大，具有明显剂量依赖性，当提取物浓度达到20 mg/mL时，抑制率较之前变化不大，当红景天多酚浓度为50 mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶抑制率高达97.86%。本试验以阿卡波糖为阳性对照[24]，其IC50为 3.36 mg /mL，红景天多酚IC50（2.83 mg/mL）低于阳性对照，表明抑制效果优于阿卡波糖。红景天多酚具有明显的α-葡萄糖苷酶抑制作用，且抑制能力强于阿卡波糖，抑制活性呈现量效关系。本研究结果与宋菲等[5]、黄晓辰等[6]对槟榔多酚、凤凰单枞多酚研究结果较为一致，抑制活性均优于阿卡波糖。

图7 红景天多酚及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.7 Inhibitory activity of Rhodiola rosea polyphenols and acarbose on α-glucosidase

2.4 红景天多酚对α-葡萄糖苷酶抑制动力学

红景天多酚对α-葡萄糖苷酶抑制的酶浓度与反应初速率结果如图8所示，酶浓度与反应速率直线具有良好线性关系，均经过原点，添加红景天多酚提取物的直线斜率小于未加多酚提取物直线斜率，且随提取物浓度逐渐增大，直线斜率逐渐减小，表明红景天多酚的添加并未增加或减少酶的浓度，而是通过降低酶活性使其分解底物浓度降低。因此，可判断红景天多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用类型属可逆抑制[25]。赵艳等[3]对雪胆多酚的α-葡萄糖苷酶抑制作用类型进行研究，表明雪胆多酚提取液对α-葡萄糖苷酶抑制作用也属于可逆性抑制类型。

图8 红景天多酚酶浓度与反应初速率图Fig.8 Rhodiola rosea polyphenols enzyme concentration and initial reaction rate diagram

2.5 红景天多酚对α-葡萄糖苷酶活性的可逆抑制作用类型

可逆性抑制类型可分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制4种类型[26]。混合型抑制又包括竞争与非竞争的混合型、竞争与反竞争的混合型2种。本研究通过保持α-葡萄糖苷酶浓度一定，改变反应体系中多酚物质与PNPG的浓度，测定体系反应速率，绘出Lineweaver-Burk双倒数曲线，如图9。不同浓度抑制剂所绘成的直线与空白组相交于第二象限，且随着抑制剂浓度的增大，米氏常数Km逐渐增大，最大反应速率Vmax逐渐降低，红景天多酚浓度由1 mg/mL增加至5 mg/mL时，其Km由 1.339增加至 3.322 mmol/L，Vmax由 0.126减小至0.078 △A/min（如表4所示），属于竞争与非竞争的混合型抑制特点[27]，因此红景天多酚对α-葡萄糖苷酶抑制类型为竞争与非竞争的混合型抑制。田丽梅[26]等研究得出，枸杞多糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用也属非竞争性抑制作用。本实验结果与槟榔多酚提取物[6]、罗汉果皂甙粗提物[28]对α-葡萄糖苷酶抑制类型相同，均属于混合型抑制。

图9 红景天多酚对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk 双倒数图Fig.9 Lineweaver-Burk double reciprocal graph of the inhibitory effect of Rhodiola rosea polyphenols on α-glucosidase

表4 红景天多酚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制动力学参数Table 4 Inhibition kinetic parameters of Rhodiola rosea polyphenol extracts on α-glucosidase

3 结论

本文采用响应面法优化红景天多酚提取工艺，得出最佳工艺：乙醇浓度71%、料液比1:40 g/mL、超声功率320 W、超声温度55 ℃，在此条件下得出多酚提取得率为11.45%。本研究采用超声辅助乙醇提取法，此方法条件简单，克服了常规方法提取时间长、操作步骤繁琐等缺点。体外α-葡萄糖苷酶抑制实验表明，红景天多酚对α-葡萄糖苷酶具有明显抑制作用，且抑制活性呈量效关系，抑制率最高可达97.86%，IC50为2.83 mg/mL，低于阳性对照阿卡波糖；酶动力学研究表明，红景天多酚提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用为可逆混合型抑制类型，属于竞争与非竞争性混合抑制。由此可见，红景天在开发成为辅助降血糖的保健食品或药品方面具有一定的发展前景。但是，目前本实验研究仅限于体外抑制实验，得出的实验结论在活体动物实验是否也能得到相同或者更好的验证有待进一步研究。