QuEChERS-SPE-超高效液相色谱-串联质谱法测定调味面制品中的12种真菌毒素

徐子婷，郝莉花，马 静，卫润鑫，李晓明，范雯婷，路书彦

（河南省产品质量监督检验院，河南郑州 450000）

辣条是一种以小麦粉和/或其他谷物粉等为主要原料，添加或不添加辅料，经配料、熟制、挤压成型、调味、包装等步骤制作而成的调味面制品[1]。调味面制品以独特的口感，在国内从儿童到老人不乏受众，就连国外也有很多爱好者，可谓是“史上最牛零食”[2]。资料显示，2009年调味面制品行业的年生产总值为100多亿元，市场销售额为170多亿元[3]，到2016年，调味面制品行业年生产总值已增至330亿元，市场销售额增至510亿元。8年间，该行业的生产总值增长230%，销售额增长200%[4]。而到2018年底，2019年初调味面制品行业年产值规模已高达580多亿元，并且这两年调味面制品生产总值、销售额仍在持续增长，已然成为全国方便休闲食品产业的新经济增长点。

调味面制品的主要原料为粮谷粉类，粮谷在生长、贮藏及运输过程中都易滋生真菌毒素[5]，且使用受到真菌毒素侵染的粮谷粉加工制成的调味面制品，在市场上很难被消费者所发现。污染粮谷类及粮谷类制品的真菌毒素主要有玉米赤霉烯酮（ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-AcDON）、赭曲霉毒素 A（OTA）和 15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-AcDON）等。同时在调味面制品的生产过程中，需要使用食用油，而植物油和油料种子在生产和储存期间极易产生多种真菌或受到多种真菌毒素的污染。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、伏马毒素（FB）类、黄曲霉（AFT）类、玉米赤霉烯酮（ZEN）等真菌毒素都极易造成食用油及其制品的污染[6-7]。目前发现这些易引起粮谷、植物油污染的真菌毒素会对人体健康产生严重威胁，过量摄入受污染的食品会导致肝肾的功能性损坏、致癌、致畸，或诱发免疫抑制性疾病[8-9]。

根据相关文献报道，真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）[10]、酶联免疫吸附法[11]、气相色谱法（GC）[12]、液相色谱法（HPLC）[13-14]及液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[15-16]；其中酶联免疫法定性不稳定，易出现假阳性，仅适用于快速检测；气相色谱-质谱联用法样品检测前常需要衍生化处理，在一定程度上受到限制[17]；液相色谱-质谱联用法拥有液相色谱高效的分离技术以及质谱高分辨率的检测能力，具有准确性好、灵敏度高、特异性和选择性强的特点，可多种组分同时检测，是现开发在复杂基体样品中同时测定多种真菌毒素的良好方法。目前我国现行的真菌毒素国标检测方法主要针对单一类或少数几种真菌毒素的检测，且前处理方法互相独立，检测效率低下。而高通量真菌毒素检测方法研究基质多为粮谷与饲料，此外关于植物油、茶叶、方便面、香辛料中真菌毒素的检测也有相应研究[18-21]，但是基质相对复杂的调味面制品中多真菌毒素的高通量检测方法目前还没有相关的报道。

同时，高通量检测方法的广泛应用，还需要有效的样品前处理方法为基础，以保证最后的分析结果[22]。目前真菌毒素检测常用的提取方法有加速溶剂萃取法、固相萃取法、免疫亲和柱法及超临界萃取法，这些提取方法常用于单一类真菌毒素的提取。而QuEChERS技术具有待测物回收率高、应用范围广、分析速度快、污染小和操作简单等优势，已广泛用于动植物源性食品中兽药、农药残留等的测定中。将QuEChERS和固相萃取（SPE）联合使用，能很好的减弱样品的基质效应。为此，本研究采用QuEChERS与SPE技术结合作为前处理方法，并对该方法进行改进和优化，在此基础上，建立了采用UPLC-MS/MS法同时测定调味面制品中12种真菌毒素的高通量检测和确定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

40份调味面制品 20份购自郑州市各大超市、小食杂店，20份购自京东、淘宝、拼多多等网站；12种真菌毒素标准品：黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、黄曲霉毒素 B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黄曲霉毒素 G1（Aflatoxin G1，AFG1）、黄曲霉毒素 G2（Aflatoxin G2，AFG2）、玉米赤酶烯酮（Zearalenone，ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynival fusenol，DON）、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Acetyldeoxynival fusenol，3-AcDON）、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-Acetyl-deoxynival fusenol，15-AcDON）、T-2 毒素（T-2 toxin，T-2）、赭曲霉毒素 A（Ochratoxin A，OTA）、伏马毒素 B1（Fumatoxin B1，FB1）、伏马毒素 B2（Fumatoxin B2，FB2） 均购自上海安谱实验科技股份有限公司。

PRiME HLB 固相萃取柱（3 cc，150 mg）、HLB固相萃取柱（6 cc，50 mg）、I-Class-TQS 超高效液相色谱-串联质谱仪 美国Waters公司；PSA、C18、中性氧化铝净化填料 月旭科技（上海）股份有限公司；氯化钠、无水硫酸镁 分析纯，天津市恒兴试剂有限公司；甲酸、乙酸铵 MS级，德国赛默飞世尔公司；乙腈 MS级，美国霍尼韦尔公司；VeloCity 14R Pro离心机 英国达美柯公司；MS-TS分析天平美国梅特勒-托利多公司；Milli-Q纯水仪 美国Millipore公司；HD-2500多管涡旋混合器 杭州佑宁仪器有限公司；5982-911012孔真空固相萃取仪美国安捷伦公司；N-Evap氮吹仪 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 提取：在50 mL离心管中称取2 g经粉碎机粉碎的均匀试样，加入20 mL 甲酸-乙腈-水（5:45:50，v/v），涡旋振荡 10 min，加入 4 g MgSO4，1.5 g NaCl，用手大力振摇 1 min。离心（4000 r/min，5 min）后，取部分上清液待净化。

净化：取萃取柱 PRIME HLB（3 cc，150 mg）放在12孔固相萃取仪上，无需活化，取0.5 mL上清液预过柱，弃去滤液。装入收集管，移取2 mL上清液过萃取柱并收集滤液，定量取1 mL滤液转移到2 mL离心管（提前装有 150 mg MgSO4，50 mg PSA，30 mg C18，30 mg Al-N）中，涡旋 1 min，离心（13000 r/min，3 min）后取 500 μL 上清液，氮吹后复溶于 500 μL 乙腈-水（90:10，v/v）中，经 0.22 μm 膜过滤后，供超高效液相色谱-串联质谱仪分析。

1.2.2 基质匹配标准溶液的制备 分别移取适量12种真菌毒素单标准溶液，用乙腈稀释并定容，配制成混合标准溶液，于-18 ℃储存。称取空白调味面制品样品，按1.2.1方法操作，得到空白基质溶液，用空白基质溶液稀释混合标准溶液配置成一系列混合基质匹配标准溶液，且现用现配。

1.2.3 色谱条件 UPLC色谱柱：CORTECS C18+（2.1×100 mm，粒径 1.6 μm）；色谱柱温：40 ℃；流动相A相：0.1%（v/v）甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸铵），B 相：0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；进样体积：6 μL，UPLC色谱梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件Table 1 HPLC gradient elution conditions

1.2.4 质谱条件 电离源：采用电喷雾电离源（ESI）正模式扫描；调整离子源温度：500 ℃；毛细管电压：1.50 kV；MS采用多反应监测方式（MRM）；12种化合物的质谱采集参照表2。

表2 12种真菌毒素的串联质谱参数Table 2 Tandem mass spectrometry parameters of 12 mycotoxins

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

本研究对测定真菌毒素的流动相进行考察，发现真菌毒素类化合物易溶于甲醇或乙腈，其中几种毒素类化合物中含有-OCOCH3乙酰氧基团，而乙酰氧类化合物在甲醇溶剂中不稳定，因此当流动相选用乙腈:水体系时，该类化合物在色谱柱上的洗脱效果和正模式下的响应强度均好于甲醇:水体系。在乙腈:水体系中尝试加入适量甲酸，发现灵敏度得到显著提高，这应该是增加了毒素类化合物在电喷雾电离时的离子化效率。当流动相选择为0.1%（v/v）甲酸水：0.1%（v/v）甲酸乙腈以初始比例90:10进行梯度洗脱时，观察到AFG2峰形拖尾严重，加入少量乙酸铵后，这种拖尾峰的情况得到有效改善。所以本研究最终选择含5 mmol/L乙酸铵的0.1%（v/v）甲酸水溶液和0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液作为流动相，其质谱图见图1。

图1 12种真菌毒素质谱图Fig.1 Mass spectrogram of 12 mycotoxins

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 样品提取溶剂的优化 本研究探究了不同提取溶剂对真菌毒素提取效果的影响，采用50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液和添加5%甲酸的50%乙腈水溶液对调味面制品中的12种真菌毒素进行提取，提取后加入 4 g MgSO4，1.5 g NaCl，用手大力振摇 1 min。离心（4000 r/min，5 min）后，取上层有机相过0.22 μm膜，上机进行测定。不同提取溶剂对真菌毒素的回收率影响见图2。

由图2可知，12种真菌毒素中，AFB2、3-ADON、OTA、FB1、FB2这5种真菌毒素在50%甲醇水溶液的回收率和50%乙腈水溶液的回收率差异性并不显著（P＞0.05），剩余7种真菌毒素的回收率有显著性差异。这是由于甲醇、乙腈作为2种通用型提取溶剂，乙腈较甲醇具有更好的选择性，可以避免提取更多脂肪、色素等杂质，且乙腈的提取效率更好，因此本研究采用乙腈作为提取溶剂[23]。

从图2中还可看出，添加5%甲酸50%乙腈水溶液，12种真菌毒素回收率均为最高。分析其原因，因为本研究待测真菌毒素中伏马毒素、赭曲霉毒素具有羧基集团，亲水性较强，使用高有机相体系会导致其回收率部分损失，故需要使用水含量较高的提取溶剂进行提取。但提取液中的高比例的水会大量溶出基质中的杂质，造成方法灵敏度降低，从而部分毒素的回收率也会显著下降[24]。同时，像DON、ZEN、OTA、FB1、FB2对酸敏感，降低萃取液的pH能提高稳定性，增加萃取效率，因此为保证各种真菌毒素的提取效果，还需在提取液中添加辅助试剂（乙酸、甲酸等），以增强联合提取的效果[11]，而甲酸、乙酸效果相近，本研究选用甲酸。

图2 不同提取溶剂对回收率的影响Fig.2 Effects of different extraction solvents on recovery rate

2.2.2 固相萃取柱的优化 由于调味面制品中有大量亲脂性杂质、中性盐的存在，会降低色谱柱的寿命，同时增大基质效应，干扰目标化合物的分析；若选择专一性较强的萃取小柱，虽然对测定某种或某类化合物的效果较好，但对多组分中性质差异较大的样品，会对某些组分的吸附性较差而影响回收率[25]。

HLB为反相固相萃取柱，对目标物进行吸附，样品中的杂质将在淋洗步骤中除去，反相萃取柱的上样液一般为大比例的水相，本研究需要把乙腈蒸发并置换成水相，才能使目标物在柱子上保留，增加了前处理时间；而Prime-HLB柱选择吸附杂质，对目标物没有吸附，作为聚合物柱不需要活化，可直接萃取，简化了过柱子流程[26]；通过考察3种加标水平下多种真菌毒素的回收率发现，Prime-HLB柱均优于HLB柱，特别是ZEN经HLB净化后回收率稳定性较差，无法准确定量。造成回收率损失的原因是在HLB这类柱子的操作中，目标物的吸附和选择淋洗液进行杂质淋洗都容易丢失化合物，且ZEN在酸性溶剂净化中才能获得较高的回收率[27]，详见图3～图5。

图3 低浓度水平（0.6～20 μg/kg）加标回收率Fig.3 Recovery rate at low concentration level (0.6～20 μg/kg)

图4 中浓度水平（1.5～50 μg/kg）加标回收率Fig.4 Recovery rate at medium concentration level(1.5～50 μg/kg)

图5 高浓度水平（3.0～100 μg/kg）加标回收率Fig.5 Recovery rate at high concentration level(3.0～100 μg/kg)

2.2.3 净化条件的优化 调味面制品中存在大量干扰物如色素、脂质等，因此净化步骤对定性、定量结果，尤其是定量的准确性非常重要。QuEChERS法常用净化填料有：石墨化碳黑（GCB）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、中性氧化铝（Al-N）和乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）等。据文献报道，GCB对具有平面分子结构的化合物有显著的吸附效果[28]，可以脱除某些色素，同时它也能脱除具有平面结构的毒素，如AFT和ZEN等[29]；C18作为非极性吸附剂能够吸附基质中非极性物质，在去除样品中的脂质、糖类等有机化合物起到有效作用，但也会使得脂溶性物质的检测结果变差，且单独使用净化能力有限；PSA是一种碱性吸附剂，在结构上有两个氨基，可以通过氢键结合去除碳水化合物、有机酸和少量色素，但它也会导致酸性化合物的检测结果减低[22]；中性氧化铝Al-N可以吸附芳香烃和脂肪胺等富电化合物。因此本研究在选取QuEChERS净化试剂时，分别选取了A组：50 mg PSA，30 mg C18，30 mg Al-N，150 mg MgSO4；B 组：50 mg PSA，150 mg MgSO4；C 组：30 mg C18，150 mg MgSO4；D 组：30 mg Al-N，150 mg MgSO4。通过比较经PSA、C18和Al-N分别与MgSO4组合净化后的样品提取液净化结果发现，对于12种真菌毒素，B组和 D组回收率较差。A组和 C组对 AFB1、AFB2、DON、3-ADON和FB2这5种毒素回收率差异性并不显著（P＞0.05），对 AFG1、AFG2、ZEN、15-ADON、T-2、OTA和FB1这7种毒素回收率差异性明显，且A组回收率普遍高于C组，表明A组不仅能起到良好的净化作用，还能得到较高的回收率，最终确定50 mg PSA、30 mg C18、30 mg Al-N、150 mg MgSO4混合填料作为QuEChERS净化吸附剂，详见图6。

图6 不同净化剂对回收率的影响Fig.6 Effects of diffent purifiers on recovery rate

2.3 方法验证

2.3.1 标准曲线与检出限 根据12种化合物的响应强弱显示，在空白调味面制品基质溶液中添加系列浓度的真菌毒素，配制标准溶液。用超高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，纵坐标选为峰面积（Y），横坐标为对应的质量浓度（X，ng/mL），绘制标准曲线，参见表3。

由表3可知，这12种化合物在0.3～1000 ng/mL质量浓度范围内能够呈现良好的线性关系，其决定系数（R2）均不低于0.99。根据添加回收试验，以3倍信噪比（S/N）确定该12种真菌毒素的检出限（LOD）为 0.10～3.0 μg/kg，以 10 倍信噪比（S/N）确定该12 种真菌毒素的定量限（LOQ）为 0.30～10.0 μg/kg。2.3.2 回收率与精密度 取空白调味面制品样品，以低、中、高（2倍定量限、5倍定量限、10倍定量限）三种浓度，每个加标水平选取6个平行样，添加12种真菌毒素标准品后按照1.2.1进行试验，12种真菌毒素的平均回收率为84.2%～97.2%，相对标准偏差为3.25%～8.77%，符合GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[30]标准中关于定性定量要求，同时也符合痕量分析标准含量低于百万分之一的要求。回收率与精密度数据见表4。

表3 12种真菌毒素的线性范围、线性方程、决定系数、检出限和定量限Table 3 Linear ranges, linear equations, determination coefficients (R2), LODs and LOQs of 12 mycotoxins

表4 空白样品中12种真菌毒素的加标回收率与相对标准偏差Table 4 Recoveries and RSDs for 12 mycotoxins

2.4 实际样品的检测

采用建立的QuEChERS-SPE-超高效液相色谱-串联质谱法对40份调味面制品进行分析，其中3份样品检出黄曲霉毒素B1，含量分别为0.32、0.62、0.66 μg/kg；2份样品检出脱氧雪腐镰刀菌烯醇，含量分别为2.4、3.1 μg/kg。现行的国家标准GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》[31]并未对调味面制品中的黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇做出限量规定，可以参考GB 2761-2017植物油脂（花生油、玉米油除外）中黄曲霉毒素B1限量10 μg/kg、花生油、玉米油黄曲霉毒素B1限量20 μg/kg；谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量1000 μg/kg。根据以上标准，本研究所取的40份样品中，虽然部分样品黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出结果呈阳性，但其含量均低于真菌毒素限量标准。

3 结论

本研究结合QuEChERS-固相萃取SPE前处理方法的优点，建立了UPLC超高效液相色谱-串联质谱法同时检测调味面制品中12种真菌毒素的检测方法。在对实际样品进行测定时，电喷雾电离源ESI+模式下，MRM多反应监测扫描，6 min内12种化合物均能出峰，同时本方法还具有较低的检出限和定量限。因此本方法具有快速、准确、回收率高，灵敏度高等特点，适用于调味面制品中12种真菌毒素残留的定性分析和定量分析，补充了调味面制品中多种真菌毒素的定量确证检测方法。