ε-聚赖氨酸作为天然防腐剂在食品中的应用研究进展

胡思嘉，李新福，熊 强

（南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京 211800）

近些年来，由于滥用食品防腐剂所引起的食品安全事故频发，消费者对相关问题的关注和担忧日益增长[1]。因此，天然防腐剂的研究和应用逐渐成为相关研究人员关注的重点。天然防腐剂有多种来源，包括植物、动物、微生物（细菌、藻类和真菌）[2]。植物源防腐剂包括迷迭香、丁香提取物、绿茶和姜黄等，其含有的活性物质已被证实具有抗氧化性和抗生物活性[3]，在食品保存上能发挥关键作用；动物源防腐剂包括溶菌酶、乳过氧化物酶、乳铁蛋白、卵转铁蛋白、抗菌肽和壳聚糖[4]；微生物源防腐剂主要包括细菌素和有机酸两大类，其中细菌素因其良好的抗菌活性且不影响食品感官品质的特性[5]，在食品防腐领域的应用愈加广泛。

ε-聚赖氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一种天然生物防腐剂，是白色链霉菌以葡萄糖作为碳源发酵得到的代谢产物之一[6]。ε-PL是由25～35个赖氨酸残基通过分子间羧基与氨基缩合形成酰胺键连接而成的L-赖氨酸同型聚合物，作为一种无毒、安全、可生物降解的多氨基聚合物，广泛用于医用抑菌和食品保鲜[7]，对致病性病原体如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌、酵母和霉菌有抗菌活性[8]。2003年，ε-PL被美国食品药品监督管理局批准为安全食品添加剂，此后在日本得到广泛应用，常见于米饭、面条、寿司、生鱼片和沙拉等食品中[9]。2014年，我国正式批准ε-PL作为食品添加剂新品种[10]，可用于焙烤食品、熟肉制品和果蔬汁类制品，其中果蔬汁类制品的最大使用量为0.2 g/L。ε-PL不仅能作为天然防腐剂在食品加工中发挥极为重要的作用，还能应用于食品包装。研究发现将ε-PL参入到明胶基质中制成的明胶/ε-PL活性可食用膜用于食品包装，能有效抑制食源性病原微生物的生长，防止食品贮藏中的氧化变质[11]。目前，国内外有许多关于ε-PL的综述，大多集中于其在不同食品中的防腐作用，关于抑菌机理方面缺乏系统总结。本文论述了近年来部分学者对ε-PL的抑菌机理研究，同时对ε-PL作为天然防腐剂在食品保鲜的应用进行介绍，并简单讨论了ε-PL在食品领域存在的问题，以期为ε-PL的抑菌机理研究和在食品工业中的进一步应用提供参考。

1 ε-聚赖氨酸的结构和理化性质

1.1 结构

ε-PL是一种聚酰胺，由25～35个L-赖氨酸残基通过ε-氨基和α-羧基缩合形成的酰胺键连接而成[12]，结构如图1所示[13]，分子量2～5 kDa[14]，作为天然防腐剂应用食品保鲜的ε-PL通常由30个赖氨酸单体构成，分子式为C180H362N60O31[15]。

图1 ε-PL 分子结构[13]Fig.1 Molecular structural formula of ε-polylysine [13]

1.2 理化性质

天然存在的ε-PL是水溶性的，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶液[16]；具有良好的热稳定性，其水溶液在120 ℃高温灭菌处理20 min不会发生分解作用[17]；具有广谱抑菌性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌的生长繁殖具有良好的抑制作用[18]。Hiraki等[19]等对ε-PL进行了毒药物动力学检测，证实了其对人体生殖系统、神经系统、免疫系统、胚胎和胎儿的发育均不存在毒性作用，而且ε-PL在人体内可被降解成赖氨酸，作为必需氨基酸被人体吸收[20]。因此，鉴于ε-PL优异的热稳定性、抗菌活性和无毒性，可作为防腐剂广泛用于食品保鲜防腐工业。此外，在食品工业中应用得更加广泛的是聚合度不超过36的天然ε-PL，原因在于聚合度低的ε-PL对某些微生物的抑制作用要好于聚合度较高的，且前者苦味较不明显，能够改善食品的感官品质[21]。

2 ε-聚赖氨酸的抑菌性及抑菌机理

目前关于ε-PL抑菌机理的研究主要集中在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及单核细胞增生增李斯特菌等，大部分是从ε-PL对微生物细胞壁和细胞膜系统、遗传物质、酶或功能蛋白的破坏三方面阐述其抑菌机制[22]。

2.1 作用于细胞壁和细胞膜系统

细胞壁和细胞膜系统是隔绝细胞内外环境的重要屏障，营养物质的吸收和代谢废物的排放均离不开这两大屏障。作为阳离子表面活性剂，ε-PL可以通过静电吸附在微生物细胞表面上，破坏了细胞壁和细胞膜的完整性，导致细胞质分布异常[23]。

据推测，聚阳离子能够抑制膜受体的活性，在脂质膜中形成脂质结构域（筏），影响脂质分子在两层脂质的小叶之间的分布，诱导融合和破坏生物膜，所有这些现象改变了生物膜的结构组织和特性，从而影响了细胞的功能[24]。王梓源等[25]以大肠杆菌作为模式菌株，研究了ε-PL作用下E.coli的生长曲线、存活率，以及ε-PL对E.coli细胞表面疏水性、内膜及外膜穿透活性的影响，发现E.coli的生长在ε-PL存在时受到明显抑制，且抑制效果和ε-PL浓度呈现正相关；此外，ε-PL的处理能够明显增大E.coli细胞的表面疏水性以及电导率，从而导致细胞膜流动性降低，稳态遭到破坏，达到抑菌效果。同时，Blachechen等[26]在喷涂薄膜的抗菌性能实验中发现ε-PL对大肠杆菌的抑制效果要好于金黄色葡萄球菌，这是由于以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌细胞壁外膜组分为脂多糖，ε-PL与带负电的脂多糖可以通过静电作用结合，破坏脂多糖结构，从而破坏细菌外膜，抑制生长。Shao等[27]在研究ε-PL乳清蛋白复合物对大肠杆菌抑制作用的过程中，揭示了ε-PL的杀菌过程，ε-PL和细菌膜通过静电作用彼此靠近，带正电的氨基与膜头部基团的氧原子之间形成的氢键捕获细菌膜的磷脂分子，随着更多的氢键形成，ε-PL像毯子一样紧贴在膜表面，最终影响膜分子之间的相互作用，并导致细菌死亡，如图2所示。此外，在低pH条件下，ε-PL有更强的抑菌效果，由于在酸性条件下的氨基质子化，具有强的正电荷，促进ε-PL在细菌膜上的吸附。但是研究证明，即使溶液的pH为12.0，ε-PL仍能保持良好的活性，这说明它的静电作用实际只是ε-PL抗菌机理的一部分[28]。

图2 ε-PL乳清蛋白复合物抑菌机理[27]Fig.2 Antibacterial mechanism of whey protein-ε-PL complexes[27]

2.2 作用于遗传物质

大量研究表明，ε-PL的抑菌作用可能与细胞内活性氧（ROS）诱导的细胞凋亡有关。Ye等[29]采用ROS探针测量经ε-PL处理的大肠杆菌ROS浓度，发现ε-PL诱导了ROS和SOS反应的产生，同时也影响细胞死亡以及调节相关基因的表达水平。同时，Tan等[30]研究了经ε-PL处理的酿酒酵母中ROS水平和核DNA变化，结果表明，ε-PL会引起酵母细胞中ROS的积累以及DNA片段化，最终导致细胞死亡。此外，还有学者探讨了ε-PL对肠球菌的抑制作用时，发现低浓度条件下，DNA在ε-PL凝胶中的迁移仍然会受到阻碍，说明ε-PL有很强的DNA结合能力，阻止DNA复制，从而影响基因在微生物体内的表达[31]。

2.3 作用于酶或功能蛋白

此外，还有部分学者研究了ε-PL对微生物的酶或蛋白质的影响，以此解析其抑菌机理。宁亚维等[32]以金黄色葡萄球菌作为指示剂，分别以抗菌肽brevilaterin、ε-PL、抗菌肽 brevilaterin和ε-PL 的混合液处理金黄色葡萄球菌，以未添加抑菌剂的为对照组，采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白含量，结果显示ε-PL处理后蛋白质条带整体灰度变浅，且在分子质量小于14.4 kDa处，ε-PL、联用组处理后蛋白质条带灰度加深，这表明ε-PL对大分子蛋白质的合成有抑制作用或者是能将大分子蛋白质降解为小分子蛋白质。在某些蛋白质的翻译过程中，ε-PL的存在也会影响翻译的继续，因为带正电荷的残基之间的排斥力会阻止α-螺旋的形成[33]。此外，ε-PL对微生物的呼吸系统防御酶和三羧酸循环关键酶具有一定的抑制作用[34]。以腐败希瓦氏菌为例，随着ε-PL浓度增加，过氧化物酶和过氧化氢酶活性下降，导致碳水化合物的代谢受阻，进而阻碍细胞生长，甚至引起细胞死亡，琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的抑制机制与之相似，两者都是通过靶向抑制的方式抑制细菌的代谢活性，如图3所示[35]。

图3 ε-PL对腐败希瓦氏菌的抑制机制[35]Fig.3 Inhibitory mechanisms of ε-PL against S.putrefaciens[35]

3 ε-聚赖氨酸在食品保鲜中的应用

ε-PL因其具有良好的抑菌功能和安全性能，在日本、韩国和世界其他地区已被普遍用作食品添加剂[36]，在日本多应用于米饭、面条、鱼类/寿喜烧、沙拉等食品中。近年来，国内外对ε-PL防腐保鲜应用的研究大多集中于果蔬、鲜乳及乳制品、肉制品以及水产品，相关学者不仅探究了ε-PL的单独抑菌作用，还进一步探讨了ε-PL与其他防腐剂或防腐技术的联用效果。

3.1 ε-PL保鲜果蔬

果蔬产品富含维生素和矿物质，可提高人体免疫力并预防疾病的发生，是人们日常饮食中不可缺少的物质[37]。新鲜果蔬极易腐烂，在运输和销售过程中易发生化学变化和微生物降解，会导致香气、味道和颜色等特征质量的下降以及有害病原体的生长[38]。为了提高果蔬产品的存储时间，研究者提出了许多物理、化学等保存手段，但出于安全性以及对食品营养价值和风味的考虑[39]，研究人员逐渐关注天然防腐剂在果蔬保鲜中的应用。

研究发现了ε-PL能有效降低冰温条件下樱桃和蓝莓的腐烂程度[40-41]，保持新鲜率，随着浓度升高，保鲜效果越好，浓度分别为500 mg/L、300 μL/g时两者能达到最佳的保鲜效果，而且适当的ε-PL处理对抑制维生素C、花色苷的减少也有很明显的效果。ε-PL还能作为一种控制水果采后病害的有效策略。灰霉病是果蔬中最具破坏性的疾病之一，由灰葡萄孢菌引起，能严重影响果蔬采后的储存[42]。目前已经证实石蒜碱[43]、壳聚糖[44]对灰霉病有一定的抑制作用，而在Li等[45]的实验中，当ε-PL浓度达到150 mg/L，灰葡萄孢菌菌丝体的生长也会受到了显著的抑制，通过研究，发现ε-PL处理的灰葡萄孢菌的细胞中的ROS水平较高，并且与ε-PL的浓度呈正相关，这也说明ε-PL抑制灰葡萄孢菌生长繁殖的原因在于ROS积累的诱导，同时ε-PL还会破坏细胞质膜的完整性。

除此之外，ε-PL能与其它防腐技术联合作用，包括非热处理的物理方法[46]（紫外线、超声波、脉冲电场等）以及与一些天然保鲜剂的复配。如使用适当的UV-A光照结合ε-PL处理鲜切菠菜，能够延缓腐败菌的生长以及维持菠菜本身良好的抗氧化性能[47]。研究还发现ε-PL结合壳聚糖处理苹果，不仅能延缓贮藏期间苹果品质的变化[48]，而且能降低青霉病的发生[49]。Song等[50]证实了乳酸链球菌素、壳聚糖和聚赖氨酸复配涂膜对鲜切胡萝卜的白化现象能表现出积极的抑制作用。

相比于其他物理、化学等果蔬保鲜方法，ε-PL是一种更加安全、健康、绿色的保存手段，在延缓腐败的同时，也维持了果蔬的营养价值和风味。

3.2 ε-PL保鲜乳及乳制品

乳制品营养丰富，含有钙、铁、锌、铜等丰富的矿物质，如今许多乳制品需要长期保存，因此需要进行杀菌处理以防止变质并延长其保质期[51]。目前食品工业中大多采用巴氏杀菌、超高温瞬时杀菌对乳制品进行灭菌处理，但都存在蛋白质变性、风味变化等问题[52]，ε-PL的出现为解决这些问题提供了新思路。

实验证明了ε-PL能有效抑制牛乳中沙门氏菌[53]、单核细胞增生李斯特菌[54]和金黄色葡萄球菌[55]的生长繁殖。奶酪中添加适量浓度的ε-PL不仅可以控制腐败霉菌的生长，还能保持其感官品质[56]。韩晴[57]通过对照试验证实ε-PL可以使牛乳中的金黄色葡萄球菌细胞结构受到损伤，其损伤程度与ε-PL浓度呈现正相关，结果表明ε-PL还可以降低乳中乳糖及蛋白质的减少量、抑制乳中酸度增加、推迟牛乳凝固时间，延缓了牛乳贮藏过程中的风味变化。此外有学者研究发现月桂酰精氨酸和ε-PL联合使用能够更明显地抑制全脂乳中单核细胞增生李斯特菌地生长[58]，具有这种协同抗菌作用的物质还有山梨酸钾[59]和乳酸链球菌素[60]。还有学者采用高压辅助ε-PL进行脱脂奶灭菌，证实在相同的灭菌条件下，添加ε-PL能降低高压处理产生的蛋白质变性程度以及营养成分减少[61]。

尽管ε-PL的使用能在一定程度上避免传统热杀菌导致的蛋白质变性等问题，但是国内外关于ε-PL在乳制品方面的报道研究仍然比较少，尤其是将ε-PL与传统乳制品杀菌技术相结合方面的研究，需要进一步探讨。

3.3 ε-PL保鲜肉制品

一般来说，肉制品容易受到微生物污染的原因与其水分活度和蛋白质含量有关，实验研究中常用菌落总数、pH、挥发性盐基氮（TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（TBA）值来评价肉制品的腐败程度[62]。

研究发现ε-PL可以抑制新鲜鸡胸肉中的脂质氧化、核苷酸分解和蛋白质分解[63]，还能有效抑制生鲜鸭肉储藏过程中TVB-N含量的升高[64]。在熟肉制品中，如牛肉泥中添加ε-PL，能有效抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌的生长，但三种病原菌对ε-PL的敏感性并不相同，这种差异可能是细菌细胞壁和表面电荷的差异所致[65]。此外，在一些肉制品的保鲜上，有学者将ε-PL与其它天然抗菌剂结合，研究协同抗菌能力。如ε-PL、谷胱甘肽的壳聚糖复合涂料不仅能抑制牛肉片中腐败微生物的生长，降低冷藏过程中pH和TVB-N值增加，还能防止牛肉片产生褐变以及感官品质的下降[66]。Liu等[67]将结合八角茴香精油、ε-PL、乳酸链球菌素的活性涂料应用于肴肉保鲜，可以使其贮藏期由8 d变为10 d，并很好保留样品的颜色、气味和整体接受度，提高易变质即食肴肉制品的质量和保质期。还有研究发现将ε-PL或ε-PLN（ɛ-聚赖氨酸纳米颗粒）结合植物提取物（包括绿茶，橄榄叶和刺荨麻提取物）替代亚硝酸加入到香肠中可以使其在冷藏过程中具有较高的抗菌、抗氧化和感官功效[68]。

实际上，ε-PL的单独添加更多出现在一些熟肉制品的加工过程中，而对于冷鲜肉类，大多数是通过制备ε-PL与其他物质结合形成的可食用涂膜进行保鲜，既延长了保质期，也不会对环境造成破坏。

3.4 ɛ-PL保鲜水产品

水产品在我们的日常饮食中随处可见，它包含了蛋白质、长链多不饱和脂肪酸、维生素、矿物质等许多营养素，长期食用这些产品能够提高身体机能[69]。然而，正是由于其营养丰富的性质，在微生物和酶的作用下，很容易引起水产品在贮存和销售过程中发生变质[70]。传统的水产品保鲜主要有冷冻保存、化学保存、辐照保存等，冷冻保存在运输过程中需要采取冷链运输，成本较大，化学保存效果良好，但长期食用会对人体产生不利的影响[71]。辐照是灭活渔业产品中食源性病原体和腐败细菌的有效措施，但消费者仍然担心它的安全性[72]。因此生物保鲜技术受到了广大研究者的关注，成为国内外水产品保鲜研究的焦点。

ɛ-PL作为安全、高效的天然防腐剂，在水产品保鲜方面具有良好的应用前景。用ɛ-PL处理黄花鱼[73]、龙虾[74]、鱿鱼[75]，发现储存过程中微生物的生长均能受到不同程度的抑制，这有利于维持良好的感官品质，延长货架期。ɛ-PL还能减少鱼类产品腥味的产生，冷藏期间河豚中的醛类含量升高，产生强烈的鱼腥味，经ɛ-PL处理后，相关化合物的含量有一定程度的降低，原因在于ɛ-PL有效抑制了脂质氧化[76]。此外，研究发现，具有高聚合度（20～30 k）的ɛ-PL 能有效地抑制鱼糜制品在冷藏储存后期出现的蜡状芽孢杆菌，一方面以ɛ-PL为代表的抗菌物质可促进蜡状芽孢杆菌分泌多糖和蛋白质类物质，从而导致细菌粘附和聚集；另一方面，ɛ-PL会破坏细胞膜并改变膜的通透性，从而导致蛋白质和DNA等细胞成分的释放[77]。这表明ɛ-PL可以作为抑制蜡状芽孢杆菌的有效试剂，从而确保鱼糜产品的安全性和质量。

ε-PL是良好的水产品保鲜剂，对水产品中的特定腐败微生物均有明显的抑制作用，同时，越来越多的研究表明ε-PL复合其他保鲜技术能达到更理想的水产品保鲜效果，这也为不同水产品的保鲜提供了更多的可能性。

4 展望

ɛ-PL作为一种优良的天然生物防腐剂，具有广谱抑菌性和生物相容性，能够有效抑制食品中腐败微生物的生长繁殖，延长食品货架期。除此之外，ɛ-PL在医药、纺织等方面也有广阔的应用发展前景。虽然ɛ-PL在食品保鲜领域中应用效果较好，但是其规模化生产和推广仍面临巨大的挑战，在国内的应用也没有日本等地区那么普遍。此外，目前国内外对其抑菌机理的研究仍然较少，大多数实验研究是从ɛ-PL对微生物细胞膜的破坏作用开展，而在核酸、蛋白质方面的机理研究尚不完整，还有待进一步的探索与拓展。同时，关于ɛ-PL作为防腐剂单独用于保鲜的研究较少，更多的是ɛ-PL与其他物质的联合处理，例如壳聚糖、VC、植物提取物等，而在相关的实验中，这些联合作用确实显示出了更优异的抑菌效果，进一步证明了ɛ-PL对食品抑菌的可行性。但在ɛ-PL和这些物质的联合作用机制以及原理方面，依然需要更为深入的探索。