多指标优选丹参提取工艺研究

闪媛媛，王 玉，徐 浪，张继斌，孙代华，陈志元

（劲牌持正堂药业有限公司 中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 黄石 435100）

0 引言

丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，被列为上品，具有活血络祛瘀、通经止痛、凉血消痈、清心除烦等功效，是常用的中药组方药材[1]。2020 年版《中华人民共和国药典》 （一部） 要求以丹酚酸B 和丹参酮类包括丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ和隐丹参酮作为质量控制指标，说明丹酚酸B 和丹参酮类在丹参的药效中发挥重要作用[2]。现代药理学研究表明丹参在治疗心血管疾病、肝硬化、溃疡、新生儿缺氧性脑病等方面具有显著疗效[3-4]。丹酚酸B 是丹参酚酸类化合物中含量较高的代表性成分，对心脑血管疾病和肝脏疾病等具有较好的临床效用[5-8]。丹参酮类主要包括隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ，其中隐丹参酮是主要的抗癌活性成分，丹参酮ⅡA 具有明显的抗炎、抗氧化、抗肿瘤活性，丹参酮Ⅰ是丹参抑菌有效成分之一，且可以治疗痤疮和心绞痛，具有改善肺部炎症、保护神经等作用[9-13]。韩丽等人[14]使用动态减压法提取丹参中丹酚酸B。高扬等人[15]以热回流法提取丹参中的丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 的。然而，关于丹酚酸B 和隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ等3 种丹参酮类同时提取的文献报道较少。试验以丹酚酸B 和丹参酮类（隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ三者之和） 提取率为指标，通过单因素试验和正交试验确定最佳的提取工艺，以期为丹参药材的充分利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

丹参，临沂九州天润中药饮片产业有限公司提供；丹酚酸B 对照品、丹参酮IIA 对照品，中国食品药品检定研究院提供；乙腈、磷酸等试剂为色谱纯、甲醇、乙醇等试剂均为分析纯、纯净水（公司生产）；95%食用酒精。

1.2 仪器

6890 型气相色谱仪，安捷伦科技公司产品；AB135-S 型电子天平，梅特勒- 托利多公司产品；FA2004 型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；SK8200LHC 型超声提取器，上海科导超声仪器有限公司产品；HH-4 型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司产品。

1.3 丹酚酸B 含量的检测

1.3.1 供试品溶液制备

精密量取丹参提取液样品1 mL 至10 mL 容量瓶中，加50%乙醇稀释并定容，0.22 μm 有机相针式过滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液备用。

1.3.2 对照品溶液制备

精密称取丹酚酸B 标准品适量至25 mL 容量瓶中，80%甲醇超声溶解并定容，混匀，配制成丹酚酸B 含量300 mg/L 左右的标准品溶液。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Waters T3 型色谱柱，流动相为乙腈∶0.1%磷酸= 25∶75，流速为1.2 mL/min，检测波长为286 nm，柱温为20 ℃。

1.3.4 丹酚酸B 含量测定

对照品溶液与供试品溶液进样体积均为10 μL，注入液相色谱仪测定。以丹酚酸B 对照品保留时间定性，以标准溶液浓度和色谱峰面积建立标准曲线，计算样品中相应的色谱峰面积，带入标准曲线得到供试品溶液中丹酚酸B 的浓度，再乘以稀释倍数即可得到丹参提取液中丹酚酸B 的含量，计算结果保留到小数点后2 位数字。

1.4 丹酚酮类含量的检测

1.4.1 供试品溶液制备

精密量取丹参提取液样品1mL 至10mL 容量瓶中，加50%乙醇稀释并定容，0.22 μm 有机相针式过滤器过滤，取续滤液作为供试品溶液备用。

1.4.2 对照品溶液制备

取丹参酮ⅡA 对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含20 mg 的溶液，备用。

1.4.3 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-Aq 型C18色谱柱，以乙腈为流动相A ，以0.02% 磷酸溶液为流动相B ，梯度洗脱程序如下：0～6 min 61% （A）、6～20 min 61%→90%（A）、20～20.5 min 90%→61%（A）、20.5～25 min 61%（A），流速为1 mL/min，柱温为20 ℃，检测波长为270 nm。

1.4.4 丹参酮类测定

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定。以丹参酮ⅡA 对照品为参照，以其相应的峰为S 峰，计算隐丹参酮、丹参酮I 的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%范围之内。

相对保留时间和校正因子见表1。

表1 相对保留时间和校正因子

以丹参酮ⅡA 的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA 的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 因素水平表

影响丹参药材提取的因素主要有提取温度、提取时间、溶剂倍数、提取溶剂等。

单因素试验因素与水平设计见表2。

表2 单因素试验因素与水平设计

2.1.2 提取温度对丹参中丹酚酸B 和丹参酮类提取效果的影响

称取丹参药材5 份，每份50 g，分别加入50%乙醇300 mL，在50，60，70，80，90 ℃等不同温度条件下，提取2 次，每次提取1.0 h，收集提取液，按规定的方法分别测定丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的含量，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

不同温度下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率见表3。

表3 不同温度下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率

由表3 可知，随着提取温度的增加丹酚酸B 的提取率呈增加趋势，分析原因为高温条件下更有利于丹酚酸B 的溶出，且在提取的短时间内丹酚酸B未发生分解。但温度对丹参酮类提取率几乎无影响。

2.1.3 提取溶剂对丹参中丹酚酸B 和丹参酮类提取效果的影响

称取丹参药材5 份，每份50 g，分别加入300 mL 20%，35%，50%，60%，70%等不同体积分数的乙醇溶液，在60 ℃条件下，提取1.0 h，提取2 次，收集提取液。按规定的方法分别测定丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的含量，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

不同乙醇体积分数下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率见表4。

表4 不同乙醇体积分数下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率

由表4 可知，不同乙醇体积分数对丹酚酸B 和丹参酮类的提取率影响不同。随着乙醇体积分数的增加，丹酚酸B 的提取率先增加后降低，变化的幅度不大，乙醇体积分数为60%时，提取率最高。丹参酮类提取率随着乙醇体积分数的增加显著增加，乙醇体积分数为70%，提取率最高。

2.1.4 提取时间对丹参中丹酚酸B 和丹参酮类提取效果的影响

称取丹参药材5 份，每份50 g，加入50%乙醇300 mL，提取2 次，提取温度为60 ℃，提取时间分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，收集提取液。按规定的方法分别测定丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的含量，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

不同提取时间下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率见表5。

表5 不同提取时间下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率

由表5 可知，随着提取时间延长，丹酚酸B 和丹参酮类的提取率均是先增加后降低，提取时间为1.5～2.0 h 时，提取率较高。

2.1.5 溶剂倍数对丹参中丹酚酸B 和丹参酮类提取效果的影响

称取丹参药材5 份，每份50 g，分别加入50%乙醇200 mL（4 BV），300 mL（6 BV），400 mL（8 BV），500 mL（10 BV），600 mL（12 BV），在60 ℃条件下，热提取1.0 h，提取2 次，收集提取液。按规定的方法分别测定丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的含量，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

不同溶剂倍数条件下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率见表6。

由表6 可知，随着溶剂倍数的增加，丹酚酸B和丹参酮类的提取率均呈现上升趋势，在溶剂倍数增加至6 BV 后，再增加溶剂倍数，丹酚酸B 和丹参酮类提取率提升的幅度有限。

表6 不同溶剂倍数条件下丹酚酸B 和丹参酮类的提取率

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，正交试验设计以提取温度、溶剂体积分数、提取时间、溶剂倍数为考查因素，设计四因素三水平正交试验。称取50 g 丹参药材，按照正交试验设计表进行提取试验，提取2 次，提取结束后合并提取液，量取各提取液体积，按规定的检测方法测定丹酚酸B 和丹参酮类含量。

因素与水平设计见表7，直观分析见表8。

表7 因素与水平设计

由表8 可知，影响丹酚酸B 提取率大小的因素依次是提取温度（A） >溶剂体积分数（B） >提取时间（C） > 溶剂倍数（D），最佳提取条件为A3B1C3D1。丹参酮类提取因素影响大小依次为溶剂体积分数（B） >提取时间（C） >提取温度（A） >溶剂倍数（D），最佳提取条件为A1B2C3D3。综合丹酚酸B 和丹参酮类的提取率，并以各自提取率的1/2加和之后的提取率作为最终的选择依据，得出最佳提取条件为提取溶剂70%乙醇，提取温度80 ℃，每次提取2 h，溶剂倍数为6 BV。

表8 直观分析

2.3 正交试验验证和提取次数的优化

按正交试验得到的工艺条件，对提取次数进行优化和正交工艺验证。分别称取丹参饮片药材50 g的样品3 份，前2 次提取液和第3 次提取液分开收集，分别检测丹酚酸B 和丹参酮类的含量，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

提取次数优化和正交验证试验结果见表9。

由表9 可知，第3 次提取丹酚酸B 和丹参酮类提取率的提取率平均值分别为11.5%和5.99%，需进行第3 次提取。3 组验证试验丹酚酸B 和丹参酮类的提取率平均值分别为82.40%和92.67%，已基本提取完全。

表9 提取次数优化和正交验证试验结果

2.4 温度对丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的稳定性影响

考虑丹酚酸B 和丹参酮类化合物对温度和加热时间的敏感性，开展丹参提取液在不同温度和不同加热时长下的稳定性考查，进一步验证提取工艺的合理性。准确吸取丹参中试第一批提取液5 mL 于试管中，共7 份，取一支做空白对照，其余6 支均分后分别置于65 ℃和80 ℃水浴中保温，连续加热8 h，分别在2，4，8 h 取出一支试管，自来水迅速冷却，转移到10 mL 容量瓶中定容，检测丹酚酸B和丹参酮类质量浓度，计算其降解率。

温度对丹酚酸B 和丹参酮类的影响数据见表10。

表10 温度对丹酚酸B 和丹参酮类的影响数据

由表10 可知，丹参提取液分别在65 ℃和80 ℃下恒温加热8 h，相同加热时间下，低温65 ℃条件下丹酚酸B 和丹参酮类的降解率略小于高温80℃，但2 种温度条件下丹酚酸B 和丹参酮类的质量浓度变化很小，由此可以说明短时间内，65 ℃和80 ℃恒温加热对丹参提取液中丹酚酸B 和丹参酮类的稳定性没有影响，此提取工艺中的提取温度和提取时间参数合理。

2.5 丹参提取工艺中试验证

丹参提取工艺确定：提取时溶剂为70%乙醇，溶剂倍数为药材量的6 BV，提取温度为80 ℃，提取3 次，每次2 h。为验证工艺条件进行3 批中试，每批次药材量为5 kg。收集提取液，检测丹酚酸B和丹参酮类质量浓度，计算丹酚酸B 和丹参酮类的提取率。

中试试验验证见表11。

表11 中试试验验证

由表10 可知，3 批中试的丹酚酸B 和丹参酮类的提取率平均分别为82.62%和94.49%。通过3 批次小试验证和3 批次中试验证研究结果，表明该提取工艺稳定、可行，重现性良好。

3 结论

试验以丹酚酸B 和丹参酮类（丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ和隐丹参酮之和） 提取率为考查指标，以提取温度、提取时间、溶剂倍数和溶剂为考查因素，设计单因素试验、正交试验进行全面考查，确定最佳提取工艺为提取溶剂70%乙醇，溶剂倍数6 BV，提取温度80 ℃，提取3 次，每次提取2 h。

温度对丹酚酸B 和丹参酮类稳定性的影响研究结果表明，提取工艺中的提取温度和提取时间参数合理。验证试验中丹酚酸B 和丹参酮类提取率均较高，表明采用此提取工艺可以同时将水溶性和脂溶性成分基本提取完全，且工艺简单稳定，重现性好，适用于工业化大生产。