传染性单核细胞增多症患儿血浆miR-155水平与EBV DNA载量的关系

陈芳芳，周 洋，王桂兰，吴小波，康厚鑫

传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis, IM）是感染性疾病，主要由EBV感染引起[1-2]。IM患儿体内有大量单核细胞急性增生，可造成多器官损伤，少数IM会诱发恶性肿瘤，且有较高的发病率[3-5]。近年来，IM易被临床医生误诊为急性化脓性扁桃体炎等疾病，导致患儿错失最佳治疗时机[6]。有文献报道EBV是IM发病的基础[7-8]。近年来发现微小RNA（microRNA,miRNA）对细胞的基因表达具有广泛调控作用，随着深入研究发现，miRNA在病毒感染中也可发挥重要作用[9]。 miR-155是免疫反应的主要调控因子，可维持免疫平衡，尤其对调控T细胞起着关键作用[10]。有文献报道miR-155在无症状期HIV感染者血浆中呈高表达，且miR-155与CD3+T细胞数量、CD4+T细胞数量具有密切关系[11]。目前，miR-155与IM患儿病情的关系鲜有文献报道，基于此，本研究拟探索IM患儿血浆中miR-155表达水平并分析其与EBV DNA载量的关系，以期为早期预估IM患儿病情提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2017年3月—2021年3月秦皇岛市第一医院收治的96例活动期IM患儿（活动期IM组）和81例缓解期IM患儿（缓解期IM组）作为研究对象，其中，活动期IM组男53例，女43例，年龄4～11岁，平均年龄（6.74±1.97）岁；缓解期IM组男46例，女35例，年龄4～11岁，平均年龄（6.62±2.03）岁。纳入标准：①符合《儿童主要非肿瘤性EB病毒感染相关疾病的诊断和治疗原则建议》[12]中IM的相关诊断标准；②初次感染EBV致IM，活动期发病时间在一周内。排除标准：①入组前3个月服用细胞毒性药物或糖皮质激素；②合并先天性免疫缺陷疾病；③合并细菌感染；④使用过丙种球蛋白治疗。选择同期在我院体检的健康儿童90例作为对照组，男48例，女42例，年龄4～12岁，平均年龄（6.88±2.17）岁。活动期IM组、缓解期IM组、对照组在性别、年龄上差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表1。本研究中患儿家属均知情同意，且通过我院伦理委员会批准（批件号LW2017-0103）。

表1 3组年龄、性别资料比较Table 1 Comparison of age and gender data among the 3 groups

1.2 方法

1.2.1 样本采集 用EDTA-K2抗凝管采集患儿及健康儿童清晨空腹静脉血1～2 ml，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 miR-155表达水平检测 取出冻存样本，解冻。离心，分离出上层血浆成分。遵照RNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）操作步骤提取血浆总RNA，用UV-1100紫外分光光度仪（济南欧莱博科学仪器有限公司）检测RNA浓度，用反转录试剂盒（上海康朗生物科技有限公司）反转录得到cDNA。采用CFX96实时荧光定量PCR仪对miR-155及内参U6进行扩增反应。引物由上海生工合成。miR-155正向引物5’-CTCGTGGTTAATGCTAATTGTGA-3’，反向引物 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；内参 U6 正向引 物 5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物 5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s，59 ℃，30 s，72 ℃，40 s；40个循环。采用2--∆∆CT法计算miR-155表达水平 。

1.2.3 EBV DNA载量检测 采用实时荧光定量PCR法检测血浆中EBV DNA载量，用EBV核酸扩增荧光定量试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司），按照标准曲线计算EBV DNA载量。按照EBV DNA峰值载量将活动期IM患儿分为[13]：EBV DNA≥3.38 lg拷贝/ml组（56例）和EBV DNA＜3.38 lg拷贝/ml组（40例）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 25.0软件对数据进行分析。计数资料用例（%）表示，组间比较采用R×C χ2检验。计量资料符合正态分布，以±s表示，2组间比较行t检验；多组比较行单因素方差分析，组内2组间均数相比行q检验。采用Pearson相关性分析对miR-155水平与EBV DNA载量的相关性进行分析，采用ROC曲线评估血浆miR-155水平对活动期IM患儿的预测价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 健康儿童与IM患儿血浆miR-155水平比较 与对照组相比，缓解期IM组、活动期IM组血浆miR-155水平均较高（P均＜0.05），与缓解期IM组相比，活动期IM组血浆miR-155水平较高（P＜0.05），见表2。

表2 对照组与IM患儿血浆miR-155水平比较（±s）Table 2 Comparison of plasma miR-155 levels between healthy children and IM children (±s )

表2 对照组与IM患儿血浆miR-155水平比较（±s）Table 2 Comparison of plasma miR-155 levels between healthy children and IM children (±s )

注：*. 与对照组相比， P＜0.05；#. 与缓解期IM组相比， P＜0.05

组别 n miR-155活动期IM组 96 2.97±0.73*#缓解期IM组 81 1.94±0.42*对照组 90 1.05±0.24 F值 265.725 P值 0.000

2.2 不同EBV DNA载量活动期IM患儿血浆miR-155水平比较 与EBV DNA＜3.38 lg拷贝/ml组相比，EBV DNA≥3.38 lg拷贝/ml组血浆miR-155水平较高（P＜0.05），见表3。

表3 不同EBV DNA载量活动期IM患儿血浆miR-155水平比较（ ±s ）Table 3 Comparison of plasma miR-155 levels in IM children with different EBV DNA loads during active periods ( ±s )

表3 不同EBV DNA载量活动期IM患儿血浆miR-155水平比较（ ±s ）Table 3 Comparison of plasma miR-155 levels in IM children with different EBV DNA loads during active periods ( ±s )

组别 n miR-155 EBV DNA≥3.38 lg拷贝/ml组 56 3.08±0.81 EBV DNA＜3.38lg拷贝/ml组 40 2.38±0.62 t值 4.587 P值 0.000

2.3 活动期IM患儿血浆miR-155水平与EBV DNA载量的关系 经Pearson相关性分析，活动期IM患儿血浆miR-155水平与EBV DNA载量呈正相关（r=0.547，P=0.000），见图1。

图1 血浆miR-155水平与EBV DNA载量的相关性Figure 1 Correlation between plasma miR-155 level and EBV DNA load

2.4 血浆miR-155水平对活动期IM患儿的预测价值 以缓解期IM患儿血浆miR-155水平为对照，ROC曲线显示，血浆中miR-155水平预测活动期IM患儿的AUC为0.869（95%CI：0.817～0.920），截断值为2.49，约登指数0.597，其敏感度、特异度分别为65.90%、93.80%，见图2。

图2 血浆miR-155水平预测活动期IM患儿的ROC曲线Figure 2 plasma miR-155 level predicts ROC curve of children with IM during active phase

3 讨 论

IM是由EBV感染引起的感染性疾病，临床发现IM患儿可死于脾破裂、气道阻塞等，少数IM患儿会伴发神经炎、肝损伤等并发症[14]。儿童期EBV感染可能导致患儿成年后仍伴有不良并发症，因此，早期诊断IM有重要意义。

目前，临床上多用EBV抗体特异性检测和EBV DNA载量检测判断EBV感染情况。近年来有文献报道EBV DNA载量对IM具有诊断价值[15]。miRNA是长约18～25 nt的核苷酸，具有免疫调控功能。有研究报道miRNA参与免疫调节过程[16]。miR-155位于21号染色体上，是miRNA家族重要成员，在T细胞分化中发挥重要调节作用。T细胞是淋巴细胞的重要成员，按CD4、CD8表型分类，T细胞可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。严格控制T细胞活化，可实现对传染病的有效免疫调控。国外文献报道，miR-155是抗病毒防御过程中激活CD4+T细胞所必需的[17]。国内文献报道肺结核患者外周血单个核细胞中miR-155高表达诱导CD8+T细胞向细胞毒性T细胞分化[18]。miR-155在炎症反应中也发挥重要作用。Zhang等[19]研究显示miR-155高表达可通过调节巨噬细胞介导的炎症反应从而促进小鼠腹主动脉瘤病情进展。Alivernini等[20]研究显示miR-155可参与巨噬细胞、树突状细胞的生物学调控，且miR-155是通过靶向调控含有SH2结构的5肌醇磷酸酶-1表达来调控炎性细胞产生炎性因子。但Natekar等[21]研究显示与野生型小鼠相比，miR-155基因敲除小鼠感染西尼罗河病毒后病毒载量更高，miR-155在神经元细胞中的过表达可通过调节抗病毒细胞因子，导致西尼罗河病毒载量明显降低。可能miR-155对不同的病毒可发挥不同的调控作用，当感染西尼罗河病毒，miR-155在体内可能发挥保护因素。本研究发现对照组、缓解期IM组、活动期IM组血浆miR-155水平依次显著升高，提示miR-155水平变化可能与IM患儿病情进程有关。Chen等[22]研究显示miR-155高水平可通过增强细胞因子信号传导抑制蛋白1（suppressors of cytokine sigmaling 1, SOCS1）途径增强HBV复制。本研究发现，EBV DNA＜3.38 lg拷贝/ml组相比，EBV DNA≥3.38 lg拷贝/ml组血浆miR-155水平较高，提示IM患儿EBV复制可能与miR-155水平有关。推测miR-155可能通过调控SOCS1途径，进而调控EBV 复制。本研究进一步发现血浆中miR-155水平预测活动期IM患儿的AUC为0.869，其敏感度、特异度分别为65.90%、93.80%，提示血浆miR-155对预估活动期IM患儿具有一定的价值，但miR-155水平预测活动期IM患儿敏感度较低，可能原因与EBV感染机体后的潜伏期有关。但miR-155影响IM患儿EBV DNA载量的具体调节机制尚未完全阐明，后续还须深入探究。

综上所述，活动期IM患儿血浆中miR-155水平呈高表达，与EBV DNA载量呈正相关。血浆miR-155水平对活动期IM患儿具有较好的预测价值，为临床上阐明活动期IM患儿EBV DNA载量升高机制奠定基础。