自噬在常染色体显性遗传性多囊肾病中的作用研究进展

何 彬,高艺源,施声淦,蒋培都

(1.电子科技大学医学院，四川 成都 610054；2.四川省医学科学院，四川省人民医院/电子科技大学附属医院 药学部个体化药物治疗四川省重点实验室，四川 成都 610072)

常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一种遗传性肾囊肿疾病，其病理特征为肾小管上皮细胞异常增殖，逐渐形成充满液体的囊泡，导致双侧肾脏进行性增大。ADPKD的致病机制复杂，PKD1基因突变(约占85%)和PKD2基因突变(约占15%)均可引起ADPKD。它多于成年后发病，发病率高(约为1/400～1/1 000)，是终末期肾病的主要病因之一，同时伴有多种肾外并发症，包括肝囊肿、颅内动脉瘤和心脏瓣膜病等[1]。目前，ADPKD发病机制尚未完全阐明，确切的分子机制仍需进一步研究。

自噬是细胞中一类依赖于溶酶体的物质降解途径，是在应激状态下维持细胞稳态和存活的重要机制。当细胞受到应激刺激，如辐射、饥饿、缺氧和细菌入侵等多种情况下，自噬降解细胞内物质产生氨基酸和脂肪酸，用于合成新的蛋白质或为能量循环再利用提供原料[2]。近年来研究表明，自噬活性的失调已成为影响ADPKD发生、发展的重要因素。因此，明确自噬在ADPKD疾病过程中发挥的作用，有助于促进ADPKD研究的进一步发展。

1 自噬与ADPKD

自噬是指细胞内的长寿蛋白、错误折叠蛋白和受损细胞器经溶酶体途径被降解的过程，在进化上高度保守。自噬分为3种类型：大自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)：1)大自噬：大自噬是最典型的自噬形式。当细胞受到环境和生理刺激时，细胞内出现隔离膜，并延伸包裹需要降解的胞质成分，形成具有双层膜结构的自噬体。自噬体与溶酶体融合产生自噬溶酶体，其中的溶酶体水解酶将降解自噬溶酶体内膜和包被物；2)微自噬：是指溶酶体膜直接通过膜内陷包裹并转运底物到腔内降解的过程；3)CMA：具体形式是胞质内的底物与分子伴侣结合，被溶酶体膜上的特异性受体识别，随后被转运到溶酶体腔中降解[2]。CMA的特征是底物直接通过溶酶体膜上的蛋白质转运复合物到溶酶体腔内。自噬作为一种主要的降解途径，在多种情况下发挥着重要作用，包括肿瘤抑制、病原体消除、免疫调节、炎症反应、细胞存活等[3]。自噬受损的细胞中，损伤的细胞器和变性蛋白质将会持续蓄积，继而破坏细胞内环境稳态；自噬过度诱导的细胞中，细胞质和正常的细胞器将会降解，最终导致细胞自噬性死亡。因此，自噬功能失调可能影响包括ADPKD在内的多种疾病的发生发展。

1.1 ADPKD中的自噬受损现象目前，就ADPKD与自噬关系的研究结论还不是非常确定，Zhu等[4]从胚胎期14.5 dPkd1-/-小鼠和Pkd1+/+小鼠胚内分离肾上皮细胞，经自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)处理后，发现与Pkd1+/+小鼠肾上皮细胞相比，Pkd1-/-小鼠肾上皮细胞中自噬体标记蛋白LC3-Ⅱ表达减弱，自噬功能受损。Rowe等[5]从Pkd1-/-和Pkd1+/+小鼠胚胎中分离出小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast cells,MEFs)，Pkd1+/+MEF细胞在经饥饿培养后，细胞通过诱导自噬以维持细胞存活，具体表现为LC3-Ⅱ的表达增强和自噬小体数量增加，而Pkd1-/-MEF细胞中自噬水平并无变化，凋亡反应增强。研究者用自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)处理Pkd1-/-细胞部分恢复自噬后，提高了饥饿培养的细胞存活率，证明多囊肾细胞中正常自噬功能发生障碍。在Pkd1基因缺失的动物模型中也发现了这一现象，Belibi等[6]使用雄性Han:SPRD(cy/+)大鼠(ADPKD模型)进行研究，发现巴弗洛霉素A1抑制自噬后，可提高野生型Han:SPRD(+/+)大鼠肾脏中LC3-Ⅱ的表达，但对Han:SPRD(cy/+)大鼠肾脏中的LC3-Ⅱ表达并无明显影响。Chou等[7]通过构建Pkd1-miRNA转基因小鼠模型，发现在小鼠肾脏中自噬相关基因的mRNA表达降低，并且肾囊肿衬里细胞中的自噬性底物p62蛋白出现蓄积，证明小鼠肾囊肿衬里细胞中正常自噬流受阻。上述研究表明，ADPKD发生发展过程中存在自噬受损现象。

1.2 ADPKD中的自噬增强现象另有研究表明,ADPKD发生发展过程中存在自噬增强现象。Tanaka等[8]使用基因靶向技术破坏小鼠Aqp11基因构建小鼠多囊肾模型，通过PCR分析发现，小鼠形成肾囊肿后，编码LC3和其他自噬相关基因的转录产物表达增加，在使用绿色荧光蛋白标记LC3的Aqp11-/-小鼠近段小管细胞中GFP-LC3阳性点的数量也增加了。这一证据表明细胞自噬增强现象存在于Aqp11-/-小鼠肾囊肿的形成过程中。Morleo等[9]观察到出生14 d后的Ofd1fl/y;creKsp小鼠肾小管逐渐扩张，随后生成肾囊肿，并伴随有细胞自噬水平升高现象；为确定自噬在肾囊肿生成中的作用，研究者敲除了Ofd1fl/y;creKsp小鼠的自噬关键基因Atg7，发现与对照组小鼠相比，Ofd1fl/y;Atg7fl/fl;creKsp小鼠的肾囊肿数量显著减少。Lee等[10]使用来自人类ADPKD样本的微阵列数据集(GSE7869和GSE35831)检测了自噬相关基因表达谱，发现几乎2/3的ATG基因在ADPKD人类样本中高表达，通过免疫荧光染色实验进一步确认LC3蛋白在ADPKD样本中的表达，发现在非ADPKD组织中LC3蛋白较少表达，但在某些ADPKD样本中LC3蛋白表达较强，在使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)处理Ift46f/f;HoxB7cre小鼠(ADPKD小鼠模型)后，小鼠肾囊肿体积显著减小。这些研究证明，在ADPKD的发生发展过程中自噬增强使肾囊肿数量增加，而抑制自噬水平增加能延缓囊肿生成。

2 影响自噬相关途径的抗ADPKD药物

ADPKD是最常见的单基因遗传性肾脏疾病之一，其主要致病基因是PKD1(编码PC1)和PKD2(编码PC2)[1]。在ADPKD患者体内的PKD1和PKD2突变将会引起多囊蛋白1(polycystin-1，PC1)与多囊蛋白2(polycystin-2，PC2)缺陷，从而影响了参与自噬调节的多条信号通路。ADPKD模型中自噬功能失调现象也启发研究者进行了一系列关于药物调节自噬的研究。针对调节自噬信号途径(Fig 1)的抗ADPKD药物在实验中表现出巨大治疗潜力。

2.1 经mTOR依赖性途径影响自噬的药物哺乳动物雷帕霉素靶标(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K相关蛋白激酶家族中的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，组成mTORC1和mTORC2两种复合物。mTOR在自噬诱导的早期过程中起关键作用，其活性主要受生长因子、饥饿等因素调节[11]。目前在多种ADPKD动物模型中发现mTOR途径被激活，而抑制mTOR途径可调节自噬活性，有效减少动物模型中的肾脏细胞增殖与囊肿生长。

Fig 1 Major autophagy pathway

Tab 1 Effects of autophagy regulatory medicines in ADPKD

2.1.1mTOR抑制剂 mTOR抑制剂可通过抑制mTOR活性，上调自噬标记因子如ULK1、Beclin-1、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Atg3/5/7/12等诱导自噬。尽管在动物实验中mTOR抑制剂表现出可延缓肾脏囊肿肿大的作用，但是在两个使用不同mTOR抑制剂的临床试验中，mTOR抑制剂并没有显著延缓患者的疾病进程。Perico等[12]将21例患者随机纳入6个月的雷帕霉素治疗组和常规治疗组。结果表明，与治疗前相比，雷帕霉素治疗后总肾体积(total kidney volume,TKV)平均增加大小小于常规治疗，但两组之间差异无统计学意义。Walz等[13]将433例ADPKD患者随机分配给安慰剂组或mTOR抑制剂依维莫司组，接受每天两次2.5 mg剂量的依维莫司或等量片剂的安慰剂;结果显示,依维莫司治疗1年后，TKV下降，但在治疗2年后TKV并无统计学差异。出现以上结果的原因可能是mTOR抑制剂使用剂量过高，患者无法耐受高剂量mTOR抑制剂的肾毒性和非肾副作用。但mTOR抑制剂在ADPKD的治疗中仍表现出较强的治疗潜力，研究发现自噬诱导剂姜黄素通过抑制STAT3途径和mTOR途径来抑制Pkd1-/-小鼠的囊肿发生，可有效延缓Pkd1-/-小鼠的肾功能衰竭，相关研究表明,这两个信号通路在自噬调节中发挥主要作用，使用姜黄素抑制mTOR调节自噬活性有助于ADPKD的治疗[14]。由此可见，使用mTOR抑制剂增强肾细胞中的自噬水平可能是治疗ADPKD的有效策略之一。

2.1.2经PI3K/Akt-mTOR途径影响自噬的药物 生长因子主要通过PI3K/Akt-mTOR途径调节mTOR活性。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)是由调节亚基(p85)和催化亚基(p110)组成的异二聚体。正常情况下，生长因子激活酪氨酸受体，活化的酪氨酸激酶通过磷酸化其底物蛋白来聚集PI3K的调节亚基p85激活PI3K。活化的PI3K在磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(phosphoinositide dependent kinase-1，PDK1)的协同下磷酸化Akt，进一步激活mTORC1，最终促进细胞生长和蛋白合成。研究表明,热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)抑制剂可通过抑制Akt-mTOR信号通路诱导自噬，Seeger-Nukpezah等[15]使用Cre-loxP系统条件性敲除Pkd1基因获得Pkd1-/-小鼠，通过每周给予Hsp90抑制剂STA-2842，持续时间超过10周可显著减少初始肾囊肿的形成和肾脏肿大，表明Hsp抑制剂对疾病进程的延缓作用可能与自噬调节有关。此外，奥曲肽可通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导自噬，显著增加肾脏细胞中自噬体的形成；Perico等[16]将100例成人ADPKD患者随机分为长效缓释奥曲肽治疗组(51例)和安慰剂组(49例)，治疗组每28 d肌肉注射20 mg长效缓释奥曲肽；对照组每28 d肌肉注射0.9%氯化钠溶液，分别观察1年和3年。结果显示治疗组患者TKV增长速率均明显减缓。由此可见，使用药物通过PI3K/Akt-mTOR途径上调自噬水平可有效减轻肾脏囊肿的形成。

2.1.3经AMPK-mTOR途径影响自噬的药物 营养物质、能量对mTOR的调节主要通过AMPK-mTOR途径。AMPK是重要的能量传感器，AMPK分子由催化α亚基和调节性β、γ亚基以异三聚体复合物的形式组成。α活化环内的Thr172的磷酸化可使AMPK活化程度最大化，该位点可被上游激酶肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)和Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶激酶β(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase-β，CaMKKβ)直接磷酸化，影响下游通路。有研究[17]发现，上调AMP/ATP比值或者升高Ca2+的浓度时，钙调蛋白依赖性蛋白激酶CaMKKβ会出现磷酸化，从而产生磷酸化的AMPK，进而通过抑制结节性硬化复合物1/2(tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2)和mTORC1的活性，提高细胞内的自噬水平。Shi等[18]研究发现，人永生化囊肿衬里上皮细胞(OX161细胞)在使用肌浆/内质网Ca2+ATP酶泵抑制剂柴胡皂苷d处理后，细胞内钙离子积累，进而激活CaMKK-AMPK-mTOR信号通路诱导细胞自噬，抑制了细胞增殖。Sun等[19]在使用一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)曲古抑菌素A(TSA)处理Pkd-/-细胞后，AMPK被激活，进而抑制mTOR活性，导致细胞中自噬相关蛋白的表达水平增加，减慢了Pkd-/-细胞的囊肿生长速度。Chang等[20]在pkd2-/-斑马鱼中观察到，二甲双胍处理后前肾中AMPK的磷酸化水平和自噬水平显著提高，斑马鱼42%～61%的前肾囊肿形成被抑制，前肾导管中细胞增殖减少。这些研究证明，多种经AMPK-mTOR途径影响自噬活性的药物，具有抑制ADPKD囊肿生成的作用。

2.2 mTOR非依赖性途径影响自噬的药物尽管mTOR依赖性途径在ADPKD的治疗中表现出较强的治疗潜力，但是药物靶向mTOR途径诱导自噬会产生很多不良反应，因此靶向其他途径调节自噬是一个新选择。最新的研究[4]显示，在pkd1a-/-斑马鱼模型中联合应用低剂量西罗莫司和卡马西平可有效延缓疾病的发展，治疗效果与高剂量西罗莫司相当，提示使用低剂量mTOR抑制剂和其他非mTOR作用靶点的药物联合调节自噬活性可能是一个新的ADPKD治疗方向。

2.2.1经Beclin-1途径影响自噬的药物 哺乳动物beclin 1蛋白是酵母自噬相关蛋白(autophagy associated protein，Atg)6/液泡分选蛋白30(vacuolar protein sorting 30，Vps30)的同源蛋白。Beclin 1主要位于反面高尔基体、内质网和线粒体，通过与Vps34相互作用，介导了自噬体的形成。Beclin 1与PI3KC3/VPS34复合体的激酶激活将会促进了PI3KC3的产生，从而在隔离膜的延伸、货物的募集和自噬体的成熟中发挥重要作用。抗凋亡蛋白Bcl-2可通过调节beclin 1和VSP34之间的解离作用，以此来影响自噬活性[21]。Pea-Oyarzun等[22]最近报道了PC2过表达可增加其与beclin 1的相互作用来诱导自噬。Zhu等[4]研究发现，在pkd1a-/-斑马鱼模型中，通过敲低自噬相关基因Atg5抑制自噬会增加囊肿的形成，而使用Beclin-1肽诱导自噬可有效延缓囊肿的形成。以上研究表明，通过Beclin-1途径增强自噬也是延缓ADPKD中囊肿形成的有效策略之一。

2.2.2经自噬-溶酶体途径影响自噬的药物 当细胞遭受饥饿、溶酶体应激、线粒体损伤等因素刺激时，定位于溶酶体膜上的TFEB发生去磷酸化和核易位，显著增加了下游包括LC3、组织蛋白酶、溶酶体相关膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1)等自噬-溶酶体途径相关蛋白的表达，促进了溶酶体生成。溶酶体与自噬体融合形成自噬溶酶体，其中的溶酶体酶会降解自噬溶酶体内膜和包被物，最终产生的降解产物通过膜渗透回到细胞质中进行再利用[23]。Peintner等[24]使用Pkd1-/-小鼠的肾髓内集合管细胞发现了Pkd1缺失使钙蛋白酶(calpain，CAPN)的活性增加，从而导致溶酶体酸化减少，LAMP1降解以及组织蛋白酶的活性降低，影响自噬溶酶体融合，抑制细胞中的正常自噬流。有趣的是，TFEB介导的溶酶体发生途径并不受Pkd1缺失的影响，这可能解释了为什么通过TFEB诱导自噬的海藻糖不能减缓Pkd1-/-小鼠的肾囊肿生长[7]。尽管这些证据表明，减少ADPKD模型中对自噬-溶酶体途径的抑制可能是抑制肾囊肿生成的有效手段，但仍存在与以上结论相矛盾的证据。Hofher等[25]发现ADPKD错义突变体PC2/TRPP2(D511V)会极大地降低TRPP2蛋白的稳定性，通过自噬抑制剂氯喹抑制自噬体与溶酶体的融合，可提高TRPP2的蛋白水平，改善了突变体的表型。由此可见，ADPKD囊肿生成过程与自噬密切相关，调节自噬-溶酶体途径可有效地影响ADPKD的疾病进程。

3 总结与展望

综上所述，自噬作为一种重要的细胞内降解途径，在ADPKD的发生发展过程中发挥着重要作用，使用药物调节和干预自噬信号通路可有效地延缓ADPKD的囊肿生成。但是目前大量研究表明ADPKD进程中存在着自噬受损和自噬诱导两种相矛盾的现象，可能影响自噬调节药物在ADPKD治疗上的使用。造成这些研究存在差异的原因可能是以下两方面：①不同的研究使用了不同的实验模型，虽然这些模型的表型都是肾脏形成肾囊肿，最终导致肾脏进行性增大，但是不同模型的造模方式不同，可能导致研究结果存在不同。②在以往的研究中LC3是主要考察指标，然而考虑到不同研究之间的差异，单一考察指标不足以反映真实的自噬水平。因此，需要在以后的研究中使用更加合适的实验模型，加强对ADPKD发病机制的理解；同时在蛋白水平上分析更多的自噬相关蛋白，以全面了解ADPKD中的自噬水平。这将有助于明确自噬在ADPKD疾病过程中发挥的作用，吸引研究者做出更进一步的研究，为ADPKD的药物治疗开辟新的领域。