基于网络药理学对黄芩-栀子配伍治疗脑缺血的研究

张行行，赵 麓，杨嘉妮，周 爽，刘继平，王 川，王 斌

(陕西中医药大学陕西省中医药管理局中药药效机制与物质基础重点研究室，陕西 咸阳 712046)

脑卒中是一组急性脑循环障碍所致的局部或全面性脑功能坏死综合征，传统医学又称“中风”，是由于毒邪损伤脑络，静脉拘挛瘀闭，气血流通失常，脑神失养，神机失守，致神昏闭缺，半身不遂；常用清热解毒药来促进气血流通，对缺血性脑卒中起到了良好的治疗效果[1]。现代医学研究表明，缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)是由于脑主动脉血流短暂或持久减少，引起的脑组织缺血、缺氧，从而引起局灶性脑组织坏死或脑软化[2]。广泛使用的治疗方法以早期溶栓恢复脑部供血为主，但大多数患者因受治疗时间窗或其他禁忌症的限制不能获得溶栓治疗，而以往“一药一靶一病”的单一环节治疗药物，忽略了机体生物过程的复杂性和多环节性，造成疗效低，在临床试验中屡遭失败 ，因此限制了其进一步发展。中医药在各种疾病的治疗中都表现出了很好的效果，具有有效性强，副作用较小，可以作用于CIS的多个病理环节，通过调整机体自身修复功能而起到治疗作用，因此有望成为治疗CIS的新突破。

黄芩-栀子作为清热类经典药对早已成功用于治疗CIS[3-4]，但配伍之后药效物质基础和作用机制尚不明确，因而限制了其临床推广和二次开发。网络药理学从中药成分、靶点与疾病间相互作用的整体性出发，运用各大数据库进行药物与疾病相关靶点信息的搜集、预测与筛选，将单个靶点或多个靶点放在整个生物网络中进行定位研究，特别适合用于中药多成分-多靶点的作用机制研究，有利于揭示中药复杂成分作用机制[5]。基于此，本文采用网络药理学方法探讨黄芩-栀子作用于缺血性脑损伤的物质基础及分子机制，以期为CIS疾病新药开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 黄芩、栀子活性成分的收集与构建在中药药理数据库(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)分别以“黄芩”、“栀子”检索其所有成分，在检索结果中设定化合物筛选条件：类药性(drug-likeness，DL)≥0.18，口服生物利用率(oral bioavailability，OB)≥40，血脑屏障透过率(BBB)≥-0.3，去重后，导入Excel表格建立黄芩、栀子配伍组分易吸收化合物库。

1.2 化合物的补充考虑化合物在中药中的含量、代谢及药理作用对黄芩、栀子有效成分进行补充，将黄芩素(baicalein,B)、汉黄芩素(wogonin，W)、黄芩苷(baicalin，BG)、汉黄芩苷(wogonoside，WG)4个化合物[6]，环烯醚萜类栀子苷(gardenoside)、京尼平苷(geniposide)、京尼平酸(geniposidie acid_qt)、二萜类西红花苷(crocin)、西红花酸(crocetin)5个化合物[7]也分别纳入黄芩和栀子的研究范围。

1.3 黄芩、栀子活性成分靶点的预测在TCMSP搜索纳入研究的活性成分的相关靶点信息并通过Drugbank数据库进行补充，筛选去重后通过Uniprot数据库筛选出人类靶点和规范基因名。

1.4 CIS相关靶点的获取以“cerebral ischemic stroke”为检索词，分别从 CTD、TTD 和GeneCards数据库收集CIS相关靶点，合并3个数据库的检索结果，去除重复靶点后，建立CIS疾病相关靶点数据库。

1.5 药物-疾病共同靶点的筛选与相互作用网络图构建运用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对黄芩-栀子预测靶点(1.3)与CIS相关靶点(1.4)进行交集并建立黄芩、栀子抗CIS的基因靶点数据库；将共同的基因靶点导入String(https://string-db.org/，Version 11.0)，物种选择Homo sapiens，Required score设为0.7；获取靶点相互作用网络，导入Cytoscape 3.7.2软件进行拓扑分析和PPI网络图的构建，并依据节点的Degree值调节网络中节点的属性。

1.6 基因通路与生物学功能的分析将黄芩-栀子抗CIS作用靶点上传到DAVID平台(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)进行GO生物学功能注释和KEGG 通路富集分析(P<0.05)，筛选出前10名GO生物学功能和前15名KEGG通路。

1.7 网络构建与分析利用黄芩-栀子与CIS交集靶点反向筛选有效成分，运用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-有效成分-靶点”网络图，借助软件network analyzer 插件进行网络度(degree)、介数(betweenness)等网络互作分析，从中分析黄芩-栀子配伍治疗CIS的药效基础。

1.8 分子对接接验证核心成分和靶点以“药物-有效成分-靶点”网络图中度值较大的有效成分和靶点为研究对象，进行分子对接验证。具体操作步骤如下：① 在TCMSP分别下载网络度较高的有效成分MOL2格式文件；② 从PDB数据库下载网络度较高的靶点蛋白pdb格式文件，利用PyMOL对原始蛋白去除水和其他无关物，拆分蛋白与原始配体并分别保存为pdb文件格式；③ 使用AutoDock Tools将标准蛋白、原始配体、核心化合物转化为pdbqt文件格式，并利用原始配体寻找到标准蛋白的活性口袋。使用AutoDock Vina标准对接程序进行核心成分与关键靶点的对接；④ 采用PyMoL软件将结合能较高的结果可视化处理。

2 结果

2.1 黄芩、栀子活性成分的筛选结果在TCMSP 数据库中共检索到黄芩143个化合物、栀子98个化合物，设定条件OB≥40%，DL≥0.18，BBB≥-0.3，筛选得到黄芩14个化合物，补充4个化合物，共18个化合物纳入研究；得到栀子5个化合物，补充5个化合物，共10个化合物纳入研究，其中，MOL000449-stigmasterol化合物为黄芩和栀子所共有。综上，黄芩和栀子共收集到27个化合物(Tab 1)。

2.2 黄芩-栀子预测靶点及疾病的收集黄芩18个活性成分从TCMSP、DrugBank数据库共收集到175个相关靶点，栀子10个化合物共收集到86相关靶点；去除重复项后，黄芩-栀子共收集到预测靶点197个；以“cerebral ischemic stroke”为检索词在CTD、TTD、GeneCards数据库中共收集到FDA批准的抗CIS相关基因靶点共2 694个。

Tab 1 Information table of active compounds of Scutellaria baicalensis Georgi and Gardenia

2.3 黄芩-栀子治疗缺血性脑卒PPI网络图的构建将黄芩-栀子预测靶点与CIS相关靶点输入Venny进行对比并取交集，归纳总结出黄芩-栀子预测靶点中有明确抗CIS作用的靶点共156个(Tab 2)，所得Venny图见Fig 1；将结果导入STRING数据库进行蛋白互作分析，再将分析结果导入Cytoscape3.7.2绘制PPI蛋白互作网络见Fig 2，其中42个节点，138条映射关系，将网络中靶点的大小按照其在网络中网络度的大小来排列，药物分子拥有的靶点数越多其网络度越大，可以得出有12个蛋白度值高于10，其中MAPK1、TNF、MAPK8、IL-6、PTGS2、IL1B等在靶点互作分析中网络度较高，表明这些蛋白在网络图中贡献度高，在PPI网络中扮演着重要的角色。

2.4 “药物-活性成分-靶点”网络图的构建利用黄芩-栀子抗CIS的156个靶点反向筛选有效成分，共得到有效成分26个，构建“药物-活性成分-靶点”网络图见Fig 3。网络图中，黄芩、栀子作为单味药时可作用于部分靶点，而作为药对使用时，两者除了可以单独作用于部分靶点外，还可共同作用于部分靶点，可以充分体现出中药复方的协同作用。

Fig 1 Scutellaria-Gardenia prediction target and CSI target Venny diagram

Fig 2 Scutellaria baicalensis-Gardenia anti-cerebral ischemia PPI network diagram

2.5 黄芩、栀子抗CIS作用靶点的分析与通路注释对黄芩-栀子抗CIS的156个潜在靶点进行GO基因富集分析和KEGG靶点通路注释分析。共得到生物学过程(biological process，BP)553个，主要参与RNA聚合酶Ⅱ的正调控、信号转导、凋亡过程、转录、炎症反应等；分子功能(molecular function，MF)105个，主要参与蛋白质结合(protein binding)、能量代谢(ATP binding)和转录因子结合(transcription factor binding)等；细胞组件成分(cellular component，CC)共61个，主要分布于等离子膜(plasma membrane)、核(nucleus)和胞质(cytosol)等，各取排名前10条，见Fig 4；共映射出通路共123条(P<0.05)，其中癌症通路(pathways in cancer)、PI3K-Akt 信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)等排列靠前，取排名前15条相关通路,见Fig 5。

Tab 2 Scutellaria-Gardenia anti-cerebral ischemia target information

续Tab 2

Fig 4 Potential target GO enrichment analysis

2.6 黄芩-栀子“成分-靶点-通络”网络分析图将富集得到的前15条KEGG通路反向筛选得到89个CIS靶点和24个黄芩-栀子活性成分，构建“药物-成分-靶点-通路”网络图,见Fig 6。其中度值较大的活性成分分别为黄芩苷、汉黄芩素、栀子苷、黄芩素、苏荠苧黄酮和千层纸素A(Tab 3)；度值较大的靶点为PTGS2、PIK3CG、AKT1、HSP90AB1、PRKACA和NOS2等(Tab 4)。

Fig 5 Potential target KEGG pathway annotation

Tab 3 Topological parameters of core active ingredients

Tab 4 Key target topological parameters

2.7 分子对接验证核心成分与关键靶点一般认为，配体与受体的结合能越低，结合的构向越稳定。结合能≤-4.25 kcal·mol-1,说明两者有一定的结合活性，≤-5.0 kcal·mol-1,说明两者有较好的结合活性，≤-7.0 kcal·mol-1,说明两者有强的结合活性。为了能更直接地阐述黄芩-栀子配伍使用抗CIS的可能作用机制。选取由网络药理学筛选得到的核心成分黄芩苷、汉黄芩素、栀子苷、黄芩素分别与关键靶点PTGS2、PIK3CG、AKT1、HSP90AB1、PRKACA、NOS2进行分子对接验证(Tab 5)，其中87.5%的成分与其靶点的结合能≤-7.0 kcal·mol-1，表明成分与其靶点均具有较强的结合活性，大部分有效成分与目标靶点的结合能比临床推介抗炎药阿司匹林的结合能还要强。利用Pymol软件将部分结合能较高的结果进行可视化处理,见Fig 7。

Fig 6 Network diagram of “drug-component-target-pathway”

Fig 7 Schematic diagram of molecular docking between Scutellaria baicalensis-Gardenia core components and key targets

Tab 5 Core compound docking results with key targets

3 讨论

黄芩-栀子为清热解毒常用药对，在心脑血管系疾病的治疗上表现出了较好的效果，但对于配伍后药效基团和作用机制的研究相对较少，本研究通过网络药理学结合分子对接技术对黄芩-栀子配伍治疗CIS的物质基础和作用机制进行了探讨。

通过数据库的收集，共筛选到黄芩-栀子27个有效化合物和197个预测靶点，CIS相关基因靶点共2 694个，对预测靶点与CIS疾病靶点进行对比分析，得到156个共同靶点，对其进行GO功能和KEGG通路富集分析，发现黄芩-栀子可能通过参与RNA聚合酶Ⅱ的正调控、信号转导、凋亡过程、转录、炎症反应等生物学过程；在等离子膜、核和胞浆等部位参与蛋白质结合、能量代谢和转录因子结合等分子反应，进而调控PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、cAMP信号通路、TNF信号通路等抑制脑卒中后炎性反应、细胞凋亡，稳定血脑屏障，改善缺血组织供血供氧，发挥抗CIS的作用。对通路反向筛选得到黄芩苷、汉黄芩素、栀子苷、黄芩素等核心成分和PTGS2、PIK3CG、AKT1、HSP90AB1、PRKACA、NOS2等关键靶点。PTGS2为前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)，又称COX-2，能够促使花生四烯酸(arachidonic acid，AA)转化成前列腺素E2(PGE2)，其通过与G蛋白偶联的前列腺素受体EP4结合而发挥生物效应，促进环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)表达增加，继而能够提高炎性因子IL-6和TNF的释放，介导发热反应，使体温升高[8]，通过抑制PTGS2的活性，可达到解热、抗炎的目的，可作为非甾体抗炎药物的作用靶点；PIK3CG是PI3K-AKT信号通路的重要信息分子，敲除PIK3CG模块后，巨噬细胞的存活率显著降低，提示增加其表达量可以抑制巨噬细胞的凋亡，同时也对巨噬细胞促炎因子——TNF-α的分泌有抑制作用，一定程度上阻滞了巨噬细胞的炎症反应[9]；AKT1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)，可以不同程度抑制CASP3、NFKB1等细胞因子表达，抑制脑卒中后炎症反应和细胞凋亡，促进细胞增殖和存活；此外，还可被多种上游细胞因子(如血管内皮生长因子等)激活,进而对缺血性损伤后的神经元发挥保护作用[10]；PRKACA属于蛋白激酶A(protein kinase，PKA)的一种催化亚基，通过阻断病毒诱导信号适配蛋白(virus induced signaling adaptor，VISA)抑制NF-κB的释放、Ⅰ型干扰素和炎症细胞因子的表达，发挥抗炎、抗病毒作用[11]；NOS2为诱导型一氧化氮合酶，诱导产生多种功能的信使分子一氧化氮(NO)，过量的NO不仅可以介导胞质靶蛋白(例如PTGS2/COX2)的半胱氨酸S-亚硝基化，参与炎症，增强促炎介质如IL-6和IL-8的合成，亦可调控基质金属蛋白酶通路破坏血脑屏障、损害线粒体功能，加重脑部供能不足[12]。结合靶点在筛选所得通路中发挥作用绘制黄芩-栀子配伍治疗脑缺血效应机制示意图,见Fig 8，讨论其治疗机制。

黄芩有效成分黄芩苷、汉黄芩素和栀子有效成分栀子苷可以抑制MAPK家族、NFKB1、PTGS2、NOS2等靶点抑制下游TNF-α、IL-6、RELA等炎症介质的释放并广泛参与细胞反应，维持脑组织稳态；汉黄芩素、黄芩素、栀子苷可以激活PIK3CG，一方面可以调节TNF-α分泌，参与炎症反应，另一方面促进Bcl-2的表达，抑制细胞凋亡；汉黄芩素、黄芩素可以激活PRKACA阻断VISA、抑制NF-κB的释放和炎症细胞因子的表达；黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素可以抑制AKT1，调控细胞增殖和生长，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程，并抑制下游CASP3、NFKB1和Bcl-2的表达；CASP3为多条细胞凋亡通路的关键性介质，黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、栀子苷均可不同途径抑制该蛋白表达，减少多腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)的裂解，缓减细胞功能障碍，促进细胞存活；HSP90AB1为热休克蛋白家族一员，黄芩素和汉黄芩素可以抑制其表达，对抗内源性损伤因子引起的毒性作用、抑制促凋亡基因、保护线粒体，维持细胞生存和功能。此外，课题组之前研究表明，黄芩苷-栀子苷(7 ∶3)配伍使用可明显降低TMF-α、IL-1β和IL-10的含量[13]，降低脑缺血侧CysLTs含量,抑制5-Lox、CysLTs1、CysLTs2蛋白表达,抑制5-LOX/CysLTs/CysLT、COX2、Toll样受体等炎性损伤通路[14]；提高Na+,K+-ATP酶活性,降低脑组织无氧呼吸,减轻细胞毒性；降低P-gp含量、AQP-4蛋白表达，改善BBB通透性，减轻脑水肿损伤，从而起到防治缺血性脑损伤的作用。总结以上，黄芩-栀子多种有效成分直接或间接作用于同一靶点，产生协同作用；作用于不同靶点，参与多途径抗脑缺血损伤，从而也证明了黄芩-栀子配伍用于CIS的依据。

Fig 8 Schematic diagram of mechanism of Scutellaria baicalensis-Gardenia in treatment of cerebral ischemia

基于受体理论，将多个核心成分和关键靶点进行分子对接验证，这些有效成分可以与多个靶点结合，且具有同常用抗炎药物如阿司匹林相近甚至更强的结合力，这些靶点分布于不同的通路，广泛参与了脑缺血后调节血脑屏障、炎症反应、细胞增殖与凋亡等过程，证明了黄芩-栀子通过多靶点、多通路参与脑缺血损伤。此外，动物实验结果也证明，黄芩苷[15]、汉黄芩素[16]、黄芩素[17]、栀子苷[18]能减轻炎症级联反应，促进脑部血流恢复，改善脑缺血损伤，可见，运用网络药理学预测黄芩-栀子治疗脑缺血的潜在物质基础具有一定的可靠性。

综上所述，与化学药“单成分-单靶点”不同的是，黄芩、栀子含有多种成分，多种成分既可以作用于不同的靶点，也可以共同作用于相同靶点，同一靶点可干预不同的生物学过程及信号通路，发挥药对之间的协同增效作用，充分体现了中药复方多成分、多靶点、多环节的优势。黄芩和栀子配伍治疗CIS可能是通过黄芩苷、黄芩素、栀子苷等有效成分调控PI3K-Akt、MAPK、cAMP、TNF等信号通路抑制脑缺血后炎性反应、细胞凋亡、稳定血脑屏障和促进脑部神经细胞增殖来发挥抗脑缺血的作用。此外，其对接位点所得信息对分析该化合物抑制活性的机制以及今后黄芩和栀子配伍的临床用药提供了一定的研究依据。下一步，我们将选择PI3K-Akt通路继续深入研究，给予脑缺血大鼠黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、栀子苷，检测血清中枢神经特异性蛋白(S100β)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、IL-6、TNF-α水平，检测脑组织PI3K-Akt通路相关蛋白表达情况，进一步探讨黄芩-栀子有效成分激活PI3K-Akt通路对脑缺血大鼠的神经保护作用。