新冠肺脾气虚方对体外新冠病毒增殖及炎症因子表达的影响

谢佩芳,李 慧,马钦海,李洪梅,李 芳,邵榆岚,方 越,沈智丽,李蓉涛,杨子峰,赵金存,董书维,杨洪军,夏雪山

(1.昆明理工大学生命科学与技术学院,云南 昆明 650500；2.中国中医科学院中药研究所,北京 100700；3.广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室,广州 广东 510120)

冠状病毒(coronavirus,CoVs)是一种单链RNA病毒,可感染人和多种脊椎动物。已知可感染人类的7种冠状病毒中,严重急性呼吸综合征(SARS-CoV)、中东呼吸综合征(MERS-CoV)和新型冠状(SARS-CoV-2)病毒因其高传染性、高致病性对社会公众健康造成了重大威胁[1]。与此同时,引起成人普通感冒的HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63 和 HCoV-HKU1这4种普通冠状病毒在儿童、老年人或免疫抑制人群中易造成严重呼吸道感染[2-3]。对于冠状病毒感染,现有临床治疗主要采用对症和支持疗法,尚缺乏特异性药物。此外,因冠状病毒具有高频率同源/异源重组和基因组灵活性等特点,使其具有较强的人群感染适应能力和逃逸药物选择压力的能力[4]。为应对常见流行冠状病毒危害、尤其新发冠状病毒的大流行,亟需筛选具有抗多种冠状病毒感染作用的广谱药物。

在冠状病毒感染过程中,刺突蛋白(spike protein,S)与细胞表面受体血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)结合,导致病毒吸附并进入细胞[5]。病毒侵入后，可激活机体免疫系统,引起MCP-1、IL-10和IP-10等免疫介质大量产生,加剧免疫反应,导致组织损伤、水肿,还容易引发二次感染,严重威胁患者健康[6]。因此,寻找限制病毒复制和抑制过度促炎反应的药物,对于减缓冠状病毒感染造成的机体损伤具有重要价值。

本研究所选肺脾气虚方(以下简称4-1)为国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》试行第四和第五版推荐处方,主要用于治疗脾肺气虚的恢复期患者,但是其治疗机理尚不清楚。本研究拟在体外水平确定4-1对新冠病毒和普通冠状病毒的抗病毒作用,并从多个炎症因子表达层面探讨其抗炎效果和抗病毒作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞和病毒 人直肠癌HRT-18细胞系(ATCC CCL-244)、恒河猴肾上皮细胞系LLC-MK2 (ATCC CCL7)、非洲绿猴肾上皮细胞系Vero E6 (ATCC CRL-1586)和人肝细胞癌细胞系Huh-7 (ATCC)由本实验室保存。HCoV-OC43 (VR-1558)、HCoV-229E、HCoV-NL63毒株由广州医科大学赵金存教授提供,SARS-CoV-2 (Genebank accession no.MT123290.1)由广州医科大学第一附属医院临床分离。

1.1.2药物 连花清瘟原料药粉(Lianhuaqingwen powder,LH)由中国中医科学院中药研究所提供,盐酸阿比朵尔片(arbidol hydrochloride tablets,ARB)(0.1 g/片)购自中海石油欧益制药有限公司,瑞德西韦(remdesivir,RDV)由广州医科大学杨子峰教授提供。新冠肺脾气虚方(4-1)饮片由中国中医科学院中药研究所提供,该处方包含法半夏9 g、陈皮10 g、党参15 g、炙黄芪30 g、茯苓15 g、藿香10 g以及砂仁6 g,煎煮方法如下：取上述药材,除砂仁外加8倍量水(加水量按总处方计算)浸泡30 min后加热煎煮,沸腾20 min,滤过,为一煎液；按砂仁重量取10倍一煎液,加入砂仁,单独煎煮10 min,过滤,为砂仁煎煮液；将砂仁煎煮液与法半夏等药渣混合,再加入8倍水,煎煮20 min,过滤,滤液与一煎液混合后通过旋转蒸发仪进行浓缩,浓缩液以1 000 r·min-1常温离心10 min,用0.45 μm滤膜过滤,得到4-1水煎剂。每毫升4-1煎剂相当于0.874 g生药。

1.1.3主要试剂和仪器 色谱纯试剂甲醇和乙腈(Thermo Fisher,美国)；RPMI 1640、DMEM培养基和胎牛血清(FBS)(Gibco,美国)；MTT噻唑兰和二甲基亚砜(DMSO)试剂(GBCBIO,中国)；RNAiso Plus (TRIzol)、RR064A One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit、RR036A PrimeScript RT Master Mix、RR390A Premix Ex Taq (Probe qPCR)、SYBR Premix Ex TapTMⅡ (TaKaRa,日本);E.Z.N.A.viral RNA extraction 162 R6874-02(Omega Bio-Tek,美国)；PCR引物(上海生工生物科技有限公司)；pEASY-T1载体 (北京全式金生物技术)；pTRIPLEscript载体(Ambion,美国)；6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS (Agilent,美国)；旋转蒸发仪(BUCHI,瑞士)；酶联免疫检测仪(美国Thermo Fisher公司的Multiskan GO)；ABI检测系统(ABI PRISM®7500 Real-time PCR system,Applied Biosystems Co,USA)。

1.2 实验方法

1.2.1药物准备 LH、ARB、RDV分别用DMSO配制成浓度为300和100 g·L-1、100 mmol·L-1的储存液。上述药物储存液及4-1水煎剂于4 ℃保存待用。

1.2.2处方煎剂LC-MS分析 将4-1中药复方及其配伍药材分别粉碎,95%乙醇冷浸提取3次(每次24 h)。合并3次提取液,减压浓缩除去乙醇,得到醇提物。取少量溶于甲醇,过滤后进行LC-MS分析。筛选在4-1复方和配伍药材中具有相同保留时间(tR)和质荷比(m/z)的分子离子峰(或准分子离子峰),通过与配伍药材的化学成分进行比较以及文献查阅,确定离子峰可能的化学组成。

1.2.3细胞和病毒培养 人直肠癌HRT-18细胞系于RPMI 1640培养基中培养。恒河猴肾上皮细胞系LLC-MK2、非洲绿猴肾上皮细胞系Vero E6和人肝细胞癌细胞系Huh-7于添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养。HCoV-OC43 (VR-1558)、HCoV-229E、HCoV-NL63和SARS-CoV-2病毒分别在HRT-18、Huh-7、LLC-MK2、Vero E6细胞中培养。以上病毒均储存于-80 ℃。用Reed-Muench法计算组织半数感染量(TCID50)。

1.2.5CPE法检测抗病毒药效 以PBS洗涤96孔板中预先铺好的单层细胞,每孔加入100 μL 100TCID50的病毒稀释液,在34 ℃、5%CO2培养箱中孵育2 h,弃去病毒液,加入特定浓度的药物,每个浓度设置4个复孔。HCoV-229E和SARS-CoV-2孵育3 d,HCoV-OC43 (VR-1558)孵育5 d(d 3补液100 μL/孔)。根据CPE分级标准记录各处理所对应的CPE情况：“+”为25%的细胞出现病变；“”为50%细胞出现病变；“”为75%的细胞出现病变；“”为>75%的细胞出现病变。用Prism non-regression analysis计算药物半数有效浓度(IC50),计算选择指数(SI)=CC50/IC50。

1.2.6药物体外抑制病毒增殖与RT-PCR法病毒载量检测 用感染复数(MOI)为1的HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和SARS-CoV-2分别感染Huh7、HRT-18、LLC-MK2和Vero-E6细胞,吸附2 h后去上清,PBS洗涤2次,随后分别加入特定药物浓度的培养基,药物浓度为：Huh7细胞,4-1为10、5、2.5 g·L-1,LH为500 mg·L-1,ARB为4 mg·L-1；HRT-18细胞,4-1为20、10、5 g·L-1,LH为600 mg·L-1,ARB为6 mg·L-1；LLC-MK2细胞,4-1为 20、10、5、2.5 g·L-1,LH为400 mg·L-1,ARB为2 mg·L-1；Vero E6细胞,4-1为10、5、2.5 g·L-1,LH为400 mg·L-1,ARB为2 mg·L-1,RDV为5 μmol·L-1；放入培养箱中继续孵育。分别孵育48、72 h (229E),72、96、120 h (OC43),120、168 h (NL63)及48 h (SARS-CoV-2 )后收集上清。用E.Z.N.A.病毒RNA提取试剂盒提取上清液中病毒RNA,按照RR064A试剂说明测定上清中病毒载量。分别扩增HCoV-OC43、HCoV-229E和HCoV-NL63核蛋白(n)基因并插入到pEASY-T1载体中,扩增SARS-CoV-2 RdRp/Helicase基因插入到pTRIPLEscript载体中,利用所得重组质粒制作标准曲线,用于计算各冠状病毒载量[7]。引物序列见Tab 1。

1.2.7qRT-PCR检测药物对SARS-CoV-2所致细胞ACE2、病毒S蛋白、IL-1α和CCL-5/RANTES mRNA表达水平的影响 SARS-CoV-2病毒吸附2 h后,去上清,加入含不同浓度药物的培养基,培养箱孵育48 h后去上清,用RNAiso Plus试剂盒提取细胞总RNA,按照RR036A说明将其逆转录成cDNA；以GAPDH为内参基因,利用SYBR Premix Ex TapTMⅡ进行qRT-PCR检测,以2-ΔΔCt方法计算。PCR检测系统为ABI检测系统。

1.2.8qRT-PCR检测药物对OC43和229E感染细胞中炎症因子表达水平的影响 OC43和229E病毒吸附2 h后,去上清,加入含不同浓度药物的培养基,培养箱分别孵育48 h (229E)和96 h (OC43)后去上清,细胞总RNA提取及逆转录方法同1.2.7；以GAPDH为内参基因,根据RR390A说明进行qRT-PCR检测促炎因子mRNA表达水平,以2-ΔΔCt方法计算。引物序列见Tab 1。

Tab 1 The primer sequences for quantitative measurement of HCoVs genes and cytokines/chemokines

续Tab 1

2 结果

2.1 4-1化学成分分析LC-MS分析表明,从4-1中药粉剂和7个配伍饮片的醇提物鉴定了94个化合物,包括17个黄酮、14个甾体、13个倍半萜、13个脂肪酸及其脂类、8个酚类、5个三萜以及24个其他类型化合物。来源于半夏的化学成分有15种,涉及不饱和脂肪酸及其酯、生物碱和低聚糖等；来源于广藿香的化合物共16种,以愈创木烷型倍半萜为主,以及一定量的广藿香油；来源于茯苓的化合物有17种,主要包括倍半萜、三萜及甾体化合物；来源于炙黄芪的化学成分共10种,涉及甾体及其苷、异黄酮及其苷,以及三萜皂苷；来源于党参的化学成分有22种,主要是炔苷、苯丙素、生物碱和芳香族化合物；来源于砂仁的化学成分有8种,涉及黄酮苷、甾体、单萜和芳香族化合物；来自陈皮的化合物有10种,包括9个黄酮及1个柠檬苦素类化合物 (Fig 1,Tab 2)。

Tab 2 Retention time and ion flow information of LC-ESI+-MS in ethanol extraction group of TCM compound 4-1

续Tab 2

续Tab 2

Fig 1 Results of LC-MS analysis of TCM 4-1 in alcohol extraction group

Tab 3 Antiviral activity of n=3)

2.2 4-1可在核酸水平抑制SARS-CoV-2体外增殖,降低SARS-CoV-2诱导的IL-1α 和CCL-5/RANTES近期研究表明，LH、ARB和RDV可以抑制SARS-CoV-2的复制[8-9]。本研究以这3种药物为对照药物,检测4-1对SARS-CoV-2的抑制作用。在SARS-CoV-2感染的Vero-E6细胞中,4-1 CC50为(141.75±1.40)g·L-1,IC50为(6.80±0.11)g·L-1,选择指数(SI,CC50/IC50)>2,说明该药物对SARS-CoV-2低毒高效(Tab 3)。进一步通过RT-PCR检测4-1对病毒核酸的抑制作用,在感染48 h时,4-1能较好抑制上清中病毒mRNA表达,且呈浓度依赖关系(Fig 2A)。4-1在10 g·L-1浓度下对对病毒复制抑制效果优于ARB (2 mg·L-1)、LH (400 mg·L-1)及RDV(5 μmol·L-1),差异具有显著性(P<0.01)。IL-1α和CCL-5/RANTES是重要的促炎因子和趋化因子,本研究结果显示,4-1能显著降低SARS-CoV-2诱导的IL-1α和CCL-5/RANTES,且高浓度10 g·L-1降低CCL-5/RANTES效果优于ARB(2 mg·L-1)和LH (400 mg·L-1)(Fig 2B)。

2.3 4-1抑制细胞ACE2受体和SARS-CoV-2病毒S蛋白mRNA表达如Fig 3所示,SARS-CoV-2感染Vero-E6细胞后,4-1持续作用48 h,在10、5和2.5 g·L-1浓度下均能降低细胞ACE2及病毒S蛋白mRNA表达水平；与ARB(2 mg·L-1)、LH(400 mg·L-1)及RDV(5 μmol·L-1)相比,中、高浓度4-1对病毒S蛋白 mRNA表达抑制效果更好(P<0.05)。

2.4 4-1对普通冠状病毒体外增殖抑制作用

2.4.14-1具备抗病毒活性 为了明确4-1是否对不同株系冠状病毒发挥抗病毒作用,本研究进一步检测该药物对3种普通冠状病毒的抑制效果。4-1对HRT-18、Huh7和LC-MK23种细胞的细胞毒性见Tab 3。通过CPE法检测发现4-1对HCoV-OC43和HCoV-229E的IC50值分别为(13.57±0.71)和(7.04±0.30)g·L-1。HCoV-NL63感染LLC-MK2细胞5 d后,通过qRT-PCR检测上清中病毒载量,其IC50为(2.64±0.14)g·L-1。如Tab 3所示,4-1对3种普通冠状病毒SI值均大于2,说明该药物具备抗3种冠状病毒活性。

Fig 2 The inhibitory rate of viral mRNA expression in supernatant and mRNA levels of intracellular pro-inflammatory cytokines after treated with n=3)

Fig 3 The mRNA levels of host ACE2 and viral S protein in SARS-CoV-2-infected cells after treated with

2.4.24-1可降低三种冠状病毒在细胞上清中的病毒载量,提高病毒增殖抑制率 3种冠状病毒分别吸附相应细胞2 h后,对药物持续作用不同时间内上清中的病毒载量进行检测。结果显示,4-1对3种病毒的抑制作用均呈浓度依赖性。在HCoV-OC43感染HRT-18细胞中,高浓度药物 (30、20 g·L-1在72和120 h时抑制率均高于50%,且4-1 (30 g·L-1)持续治疗120 h时,其抑制率明显高于LH(600 mg·L-1)(P<0.01)；相比浓度为6 mg·L-1的ARB,4-1在30、20 和10 g·L-1浓度下抑制效果更好(P<0.01)(Fig 4A)。对于HCoV-229E感染Huh7细胞,4-1 (20 g·L-1)持续作用72 h时,其抑制率显著高于ARB(4 mg·L-1),且不同浓度的抑制效果均优于LH(500 mg·L-1)(Fig 4B)。在HCoV-NL63感染LLC-MK2细胞中,高浓度4-1(20 g·L-1)持续作用120和168 h时,其抑制效果差异无统计学意义,而低浓度(2.5 g·L-1)药物抑制效果在120 h时优于168 h(P<0.01)。药物持续作用120 h时,4-1(20 g·L-1)抑制率优于ARB(2 mg·L-1)和LH (400 mg·L-1)(Fig 4C)。上述结果表明,4-1通过抑制上清中病毒载量从而发挥对多株系冠状病毒的广谱抗病毒作用。

2.5 4-1抑制普通冠状病毒感染诱导的细胞因子/趋化因子表达以过度促炎介质的产生或免疫细胞募集为特征的异常免疫反应可加速疾病的发病过程。因此,我们进一步检测4-1对229E及OC43感染细胞中炎症介质表达的影响。结果显示,HCoV-OC43感染96 h和HCoV-229E感染48 h均导致IL-6、CXCL-8/IL-8、CXCL-10/IP-10、TNF-α、IFN-α、CCL-2/MCP-1、CXCL-9/MIG和CCL-5/RANTES的mRNA水平显著升高,而4-1可降低上述基因mRNA表达水平,该药物作用呈浓度依赖性(P<0.01)(Fig 5A,5B)。与对照药物相比,在HCoV-OC43感染细胞中,ARB (6 mg·L-1)对CXCL-8/IL-8、IL-6、CXCL-10/IP-10、TNF-α的作用优于中低剂量的4-1 (Fig 5A)；在HCoV-229E感染细胞中,除CXCL-9/MIG外,不同剂量4-1以及LH (500 mg·L-1)对各炎症因子表达水平的抑制作用均优于ARB (4 mg·L-1)(Fig 5B)。这些结果表明,4-1对多株系冠状病毒感染诱导的促炎反应具有缓解作用。

3 讨论

肺脾气虚方主要用于改善新冠患者恢复期症状,包括恶心乏力、倦怠、痞满,大便粘稠、舌苔白腻等。与一定剂量的LH和ARB相比,4-1对病毒复制抑制的效果更好,抑制作用可持续至感染后期。广藿香具有抗病毒抗炎作用,调节免疫,止咳、平喘、止呕,其有效成分广藿香油能有效抑制病毒复制[10]；来源于炙黄芪的苷类化合物能抑制流感病毒H1N1、合胞病毒RSV及登革病毒的增殖[11-12]。4-1配伍中含有广藿香油,苷类等化合物,这也许是其能普遍抑制多种病毒增殖,且对不同病毒的感染后期也有一定的抑制效果的原因之一。

Fig 4 The inhibitory rate of common coronaviruses mRNA expression in supernatant after drug n=3)

Fig 5 Expression of pro-inflammatory cytokines after treated with n=3)

病毒粒子的迁移由S蛋白主导。S蛋白识别受体,吸附并进入宿主细胞。这种S蛋白-受体的相互作用支配着病毒的组织趋向性[5-6]。4-1一方面通过抑制SARS-CoV-2的复制从而降低S蛋白的表达,另一方面一定程度上干扰了宿主细胞受体ACE2的合成,从而减少病毒的迁移和吸附。

冠状病毒侵入宿主细胞后可促发级联反应,并导致炎症因子风暴的产生,从而加剧疾病进程[13]。ARB (4 mg·L-1)对229E感染引起的炎症因子表达上调作用有限,除 CXCL-9/MIG外该药物不能显著降低其余炎症因子 mRNA表达水平。而4-1可普遍降低SARS-CoV-2、OC43和229E感染诱导的细胞因子/趋化因子mRNA表达水平。这可能与4-1含有多种抗炎成分有关。以往研究显示,来源于广藿香的倍半萜化合物能抑制脾细胞增殖[14]；黄芪活性成分如黄芪甲苷等能诱导T细胞激活、增强CD45磷酸酶活性、抑制促炎细胞因子上调等,参与免疫调节[15]；此外党参补脾肺气,改善机体免疫功能[16]。而LC-MS分析提示4-1中含以上抗炎成分,这些结果表明,新冠肺脾气虚处方4-1对多种病毒具有潜在的抗炎作用。

综上,本研究证明了该处方能有效抑制多种冠状病毒的增殖及炎症发生,且抗病毒效果可持续到感染后期。为临床推荐恢复期用药提供了一定的基础证据。