不同剂量多西紫杉醇诱导神经病理性疼痛模型大鼠的研究

罗维昊

摘要：目的：探討不同剂量的多西紫杉醇坐骨神经旁诱导治疗神经病理性疼痛的实验研究。方法：选取SD大鼠40只，随机分为：1.假手术组（FS组）：只解剖暴露坐骨神经不置管给药;2. 以 1∶ 1的聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇为载体组（TR组）;3.神经旁多西紫杉醇低剂量组（0.1mg）（L组）和神经旁多西紫杉醇高剂量组（1mg）（H组），每组10只。假手术组单纯暴露坐骨神经，载体组、神经旁多西紫杉醇低剂量组和神经旁多西紫杉醇高剂量组大鼠建立神经旁置管模型。模型建立后，假手术组不予处理，生理盐水组注射生理盐水，神经旁多西紫杉醇低剂量组和神经旁多西紫杉醇高剂量组分别注射0.1mg、1mg多西紫杉醇。各组大鼠分别术前和术后 1、3、7、14、21 d测定50%机械刺激撤足阈值及热刺激撤足潜伏期的影响，，ELISA检测坐骨神经中CGRP的表达。结果：给药3 d、7 d后，神经旁多西紫杉醇低剂量组和神经旁多西紫杉醇高剂量组PMWT分别为（4.52±0.73） g和（5.53±0.70） g、（5.15±0.71） g和（6.35±0.80） g，PWL分别为（7.12±1.03） s和（8.31±1.20） s、（8.13±1.32） s和（9.20±1.21） s，明显高于载体组（P<0.05）与假手术组（P<0.05）;其中神经旁多西紫杉醇高剂量组PMWT和PWL明显高于神经旁多西紫杉醇低剂量组（P<0.05）。神经旁多西紫杉醇低剂量组和神经旁多西紫杉醇高剂量组脊髓背角CGRP表达量分别为（1.751±0.120）和（1.322±0.118），明显高于载体组（P<0.05）与假手术组（P0.05）;其中神经旁多西紫杉醇高剂量组明显高于神经旁多西紫杉醇低剂量组（P<0.05）。结论：高剂量多西紫杉醇制备神经病理性疼痛模型更为稳定，其机制可能与CGRP表达有关。

关键词：多西紫杉醇;化疗并发症;神经病理性疼痛

【Abstract】Objective： to investigate the effect of different docetaxel doses on neuropathic pain induced by SCIATIC nerve. Methods： 40 SD rats were randomly divided into 4 groups： 1. Sham-operation Group （FS group） ： Only anatomically exposed sciatic nerve were given without indwelling tube; 2. 1∶1 castor oil of polyoxyethylene and anhydrous ethanol as carrier Group （T Group） ; 3. The low-dose group （0.1 mg） and the high-dose Group （1 mg）（h group） of Paclitaxel were 10 rats in each group. The rats in sham-operation group were exposed to Sciatic nerve alone， and the rats in carrier group， low-dose Group and high-dose Group were subjected to nerve-side Catheterization. After the model was established， the sham-operation group was not treated， the normal saline group was injected， the low-dose Group and the high-dose group were injected with 0.1 mg and 1 mg respectively. Before and 1，3，7，14，21 days after operation， 50% mechanical stimulus withdrawal threshold and the influence of thermal stimulus withdrawal latency were measured， and the expression of CGRP in Sciatic nerve was detected by Elisa. Results： After 3 D and 7 D administration， the PMWT in low dose group and High Dose Group were （4.52 ± 0.73） G， （5.53 ± 0.70） G， （5.15 ± 0.71） G and （6.35 ± 0.80） G， respectively， pWL was （7.12 ± 1.03） s and （8.31 ± 1.20） s， （8.13 ± 1.32） s and （9.20 ± 1.21） S， respectively， which were significantly higher than those in carrier group （p < 0.05） and Sham Operation Group （p < 0.05）  PMWT and PWL in the high dose group were significantly higher than those in the low dose group （p < 0.05） . The expressions of CGRP in the Dorsal Horn of spinal cord in the low dose group and High Dose Group were （1.751 ± 0.120） and （1.322 ± 0.118） ， respectively， which were significantly higher than those in the carrier group （p < 0.05） and Sham Operation Group （P0.05）  The high-dose Group was significantly higher than the low-dose group （p < 0.05） . Conclusion： The model of neuropathic pain induced by high dose Docetaxel is more stable， and the mechanism may be related to the expression of CGRP.

【Keyword】Docetaxel; complications of Chemotherapy; neuropathic pain

多西紫杉醇是半合成紫杉烷的一种，作为常见化疗药用于许多实体肿瘤的治疗[1]。化疗导致的神经病理性疼痛（CIPN）是限制多西紫杉醇治療剂量的主要不良反应[2]。此外，多西紫杉醇引起的周围神经病疼痛通常演化为一种慢性疾病，难以治愈，进而影响癌症幸存者的生活质量[3-4]。多西紫杉醇主要利用与微管的 β-微管蛋白结合发挥抗癌作用，从而使细胞周期阻滞和发生凋亡。然而，多西紫杉醇引起的机械性异位疼痛的原理机制尚未研究清楚。

目前，化疗药物制备模型的方法主要包括腹腔注射，静脉注射已经神经旁注射，腹腔注射的优势在于药物吸收稳定，操作简单，大鼠耐受性较好，然而CIPN的制备难度较高，造模不稳定[4]，尾静脉注射药物浓度计量可控，效果尚可，然而大鼠配合难度较大，长期用药较困难，需麻醉后置入静脉导管[5]，最近的研究当中，一次性埋入凝胶海绵导管后多次给药简便，精准给药对比较为明确，因此本课题拟对神经旁给药建模浓度进行评价。

材料与方法

1. 大鼠

实验采用雄性的SD大鼠， 体重150 -170 g， 由本院实验动物中心供应。动物分笼饲养， 自由饮食， 室温保持在 （24±1） ℃和 50% -60%的湿度， 12 h -12 h白天 -黑夜循环照明 。假手术组 （FS 组，n = 10） 只分离暴露坐骨神经不进行其他处理;载体组（TR组，n = 10）只暴露右侧坐骨神经置管后给予空白载体;低剂量多西紫杉醇组（L组， n = 10）暴露右侧坐骨神经后置管建立CIPN模型;高剂量多西紫杉醇组（H 组，n = 10）暴露坐骨神经周围置管建立CIPN模型。

2. 药物

药品及试剂： 多西紫杉醇，购自江苏恒瑞医药股份有限公司，批号 0811201。溶剂聚氧乙基蓖麻油 /无水乙醇 （1∶1）。兔抗人PGP9. 5多抗，Abcam 公司，德国; 小鼠抗大鼠 MHCclass II RT la （OX-6 ） 单抗，Abcam公司，德国; Cy3标记驴抗兔 IgG，Bio公司，美国; FITC标记驴抗小鼠IgG，Cruz公司，德国。

3. 坐骨神经旁置管模型制备与给药坐骨神经附近的导管埋入

以 Chacur等[6]的实验为基础加以进一步的改进。裁剪明胶海绵为成20 mm长 、 4 mm宽 、10mm高的长块状。切开 1端并分成两半然后置入1根 5 cm长的 PE-10管， 套线将 PE-10管与明胶海绵结扎加固在一起。70%乙醇浸泡 15 min， 无菌超净台吹干备用。大鼠用10%水合氯醛麻醉 （3.5 mL/kg， ip）， 然后于右后肢备皮消毒。将明胶海绵包裹覆盖于分离好的右侧坐骨神经上， 通过PE-10管注入0.1mg/1mg多西他赛或载体。每天1次， 共21d。

4. 行为学测试

行为学实验与给药分别交由不同的志愿者。大鼠放在升高的铁丝网上，限制其活动范围于透明有机玻璃盒（40 cm × 15 cm × 20cm）下方，行为学实验于自由活动10min后开始。机械性异常性疼痛、机械性痛觉过敏分别通过4g和15g折力的测痛丝进行测试。每只大鼠折力由小到大的顺序进行测试时。测痛丝刺激大鼠后足掌底中部5 s，每种折力的测痛丝刺激每只后足5次，每只大鼠共刺激10次。大鼠两只后足对 4g、15 g 测痛丝刺激的反应次数和总刺激次数的百分比分别作为该只大鼠的机械性异常性疼痛、机械性痛觉过敏的程度。

5. 热刺激撤足潜伏期的测定

使用热平板测试仪检测大鼠后肢足跟部皮肤对热伤害性刺激的反应。测试前将大鼠放置于平板测试仪的有机玻璃箱内约5min， 测试时将可移动的热辐射光源通过透明玻璃板输出红外线热刺激并聚焦于大鼠后肢足跟部。热刺激强度以正常大鼠光照10 s-15 s左右出现撤足反应为宜。在大鼠撤足的瞬间或人为设定热刺激25 s（为防止长时间热刺激烫伤大鼠）， 热光源自动关闭， 计时器自动停止， 可准确记录下大鼠的热刺激撤足潜伏期。以 5 min的间隔对双侧后足各测3次， 3次撤足潜伏期的均值用于最后的统计学分析。

6. CGRP检测

分别于造模后1、3、7和21d时每组随机取5 只大鼠，采用免疫荧光法测定背根神经节神经元 CGRP表达水平。腹腔注射4%水合氯醛400 mg/kg麻醉后，37℃生理盐水经大鼠心脏灌注冲洗，后经4℃4%多聚甲醛灌流固定，取坐骨神经.放人4℃4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中后固定 6-8 h，再放入30%蔗糖中4℃过夜。待组织固定后行冰冻切片，切片厚度约20μm。3%小牛血清室 温封闭2 h后，滴加羊抗CGRP一抗，4℃孵育24 h;滴加Alexa Fluor 488标记的二抗，室温避光孵育2 h，10%甘油封片。采用荧光显微镜获取图片。每组随机选取6～8张切片，每张切片取3～5个视野，计数阳性神经元，CGRP阳性神经元呈绿色荧光，取其平均值反映蛋白表达水平。

7.统计学分析

采用SPSS 21.0统计学软件进行分析，资料数据以均数 ± 标准差 （x±SD） 表示，组间比较采用成组设计资料的t 检验，组内比较采用单因素方差分析。以 P < 0.05 为差异有统计学意义。

结果

2.1体重

多西紫杉醇对SD大鼠一般情况的影响实验期间未观察到5组大鼠出现脱毛、腹泻、运动失常等情况。每2 d或3d 测定大鼠体重一次。从图 1的体重动态观测表中可以看出，坐骨神经旁给药5次多西紫杉醇对 SD大鼠的体重增长没有明显的影响。

2.2各组大鼠机械刺激缩足反应阈值（PWMT） 和热刺激缩足反应阈值（PWTL）

行为学的改变与FS组和同时间点的CR组相比，L组与H组在术后 3 ～ 21 d 机械痛阈和热痛阈均明显降低，其中以14天时降低最为明显，21 天时有升高的趋势，结果提示CIPN模型建立成功。L组与R组相比，H组PWMT和PWTL明显上升（P < 0.05）。提示较高剂量多西紫杉醇更易表現为CIPN症状（见表2、3）。FS组与TR组比较无统计学差异（P > 0.05）。

2.3CGRP表达水平

与FS组以及TR组比较，L组与H组在术后 3～21 d CGRP水平皆有降低，后期下降较为平缓。L组与H组相比，H组PWMT和PWTL明显上升（P < 0.05）。提示较高剂量多西紫杉醇更易表现为CIPN症状（见表2、3）。FS组与TR组比较无统计学差异（P > 0.05）。

讨论

多西紫杉醇是从短叶红豆树皮中分离出来的化疗药物。其常见的毒副作用有： 1.骨髓抑制;2.肾毒性;3.外周神经毒性。骨髓抑制和肾毒性可以通过粒细胞集落刺激因子和大量饮水处理。但是，外周神经毒性由于机制研究并不完善缺乏有效治疗手段，是其重要的剂量限制因素。

多西紫杉醇可导致患者的感受神经元异常和神经痛等的严重的化疗药导致的外周神经病变，包括机械性异常性疼痛、冷敏异常性疼痛、持续性灼烧痛、机械痛觉过敏麻刺感和麻木等症状，且这些症状不会随着化疗药的停药而得到缓解，而是持续数月甚至数年[2]。同时，因为CIPN多对目前临床上所使用的镇痛药物不敏感，ke能会使部分患者被迫减少化疗药的剂量甚至停药，继而影响化疗效果甚至使化疗归于失败。研究显示，CIPN 发生发展的机制尚未完全阐明，也没有可以有效缓解或治疗 CIPN 的药物问世[4，5]。

有研究使用多西紫杉醇腹腔注射建立SD大鼠外周神经病变模型，然而建立条件及方法差异较大（如给药剂量、给药频率、动物品系、测定方法等）。甚至不同品种实验动物在实验CIPN有效药物时亦有不同表现，最终影响实验结论。部分研究采用了 Wistar 大鼠、C57BL /6和ddY等小鼠作为模型动物[4-8]。SD大鼠仍是当前采用较多的 CIPN 模型动物。

研究 CIPN的常用方法包括机械缩足反射、热敏实验和冷敏实验。对各种文献荟萃发现，选择机械缩足反射测定特定刺激力度缩足比率的报道比例最大，该实验周期较长 （约为 20～30 d） [5，9，10，11]，较为符合实际情况，结果相对真实;采用机械缩足反射测定缩足阈值的报道相对较少，且实验周期较短（5～7 d） ，适合作为预实验或初步CIPN药物的筛选。

本研究选择了贴近临床状态的机械缩足反射测定特定刺激力度缩足比率的方法。采用机械缩足反射法测定大鼠疼痛常用 4 -15 g 折力的测痛丝。因为正常大鼠受到 4 g 折力测痛丝的刺激发生缩足反射的频率很低，而CIPN模型大鼠受到4 g折力的刺激会出现明显的缩足反射，因此4 g折力对大鼠足底的刺激所引起的反应最能够代表机械性异常性疼痛。正常大鼠受到15 g折力的测痛丝刺激后约5～20%的几率发生缩足反射，而CIPN模型大鼠受到 15 g 折力的刺激出现缩足反射的几率明显上升，因此15 g折力的测痛丝对大鼠足底的刺激所引起的反应最能代表机械性痛觉过敏[12]。

本研究在不损伤神经的情况下， 坐骨神经周围给予不同剂量的多西紫杉醇可引起大鼠右侧后爪机械刺激和热刺激痛觉过敏， 持续约20 d。即外周神经未产生物理性的损伤， 疼痛也可以产生。将载体溶剂与坐骨神经旁注射也可引起痛觉过敏[ 8]，这是由于激活了坐骨神经周围免疫反应 [ 9] 。而正常周围神经免疫系统的激活已足以引起疼痛 [ 9， 10] ，较高剂量的多西紫杉醇效果进一步加强。一些研究显示低计量的多西紫杉醇可以制备出类似神经损伤以后产生的疼痛行为学变化，引起雪旺氏细胞脱分化， 激活巨噬细胞等等 [ 13] 。坐骨神经周围包裹明胶海绵再给予多西紫杉醇引起的痛觉过敏可以持续 20 d左右。这可能是由于给药方式的不同导致的。 本研究报道坐骨神经旁给予化疗药物建立的动物模型相对稳定、可靠，为进一步研究 CIPN 发生的机制奠定了一定基础

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基金來源：肿瘤转化医学种子基金 （1906-1）