“蜡样”透明带卵子对体外受精-胚胎移植周期中助孕结局的影响*

徐鸿毅，陈 鑫，田佳榕，廖晖淇，张 鑫，李 欣，席园园，张昌军,4

(1.湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心，十堰 442000；2.湖北省生殖医学临床医学研究中心，十堰 442000；3.湖北医药学院生物医药研究院，十堰 442000；4.湖北医药学院生物医学工程学院，十堰 442000)

在人类辅助生殖助孕技术(assisted reproductive technology,ART)中，获得高质量的胚胎对患者最终获得成功妊娠非常重要。卵子质量是影响配子受精和胚胎质量的重要因素。目前卵子形态学特征是有效评价卵子质量和预测胚胎发育潜能的指标。透明带是卵子重要组成部分，同时也是反应卵子质量的指标之一，其形态或结构异常改变影响着卵子的发育、受精及后期胚胎质量和妊娠结局[1]。本研究中的卵子透明带形态学异常，是卵子异常中具有特征性的一种，表现为致密透亮，呈“蜡样”变性，卵周间隙小，第一极体不明显等。本文旨在探讨所致透明带异常的可能原因以及其对后期受精和胚胎结局的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾分析2015年1月至2018年12月在湖北医药学院附属人民医院生殖医学中心行辅助助孕患者共478例，其中均为特征性的致密透亮“蜡样”透明带卵子共114例,排除透明带颜色异常，部分透明带异常及其他类型的异常。再根据透明带表面不同形态分两组：透明带表面毛刺状组：表面呈毛刺状，其他表现部分卵周间隙小，第一极体不明显；透明带表面光滑组：表面光滑，其他表现卵周间隙小或无，第一极体不明显，卵子部分外周颗粒细胞和放射冠缺如。见图1。相同条件下同一天取卵中同一方案随机选取透明带的形态正常组364例,且均为选择D3胚胎移植。所有患者平均年龄(30.02±4.12)岁，不孕年限(4.18±2.24)年，不孕原因包括为输卵管性不孕254例,排卵障碍82例，子宫内膜异位症22例,多囊卵巢综合征32例，原因不明19例，男性因素86例，混合型因素17例。3组不孕原因的比例均无显著差异，男女双方染色体均正常。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则。

图1 两种异常形态透明带卵子

1.2 超促排卵及卵泡监测 本中心主要方案为长效降调节方案和高孕激素状态下促排卵(PPOS)方案。长效降调节方案：月经第3天行B超及血清抗苗勒管激素(AMH)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌激素(E2)、孕激素(P)检查，予长效达菲林(德国辉凌公司产)3.75mg肌注，35天后行B超及血清性激素检查，当E2<50pg/mL，LH<5mIU/mL，FSH<5mIU/mL，P<1ng/mL，则开始启动外源性重组促性腺激素(Gn)(rFSH，默克雪兰诺，德国)75～300IU/d或人绝经期促性腺激素(hMG，珠海丽珠)。卵泡直径达到16mm，开始每日行B超及血清FSH、LH、E2、P检查，当至少3个优势卵泡直径达到20mm，注射HCG 10000IU(HCG，珠海丽珠)，34～36h后阴道超声引导下经阴道穿刺取卵。PPOS方案：月经第2～3天行B超及血清FSH、LH、E2、P检查，开始口服安宫黄体酮片10mg/d，同时给予Gn 75～225IU/d，当主导卵泡直径达到18～20mm，停用Gn和安宫黄体酮，同时注射达菲林(或达必佳)0.1～0.2mg，加HCG 2000IU，36～37h取卵。

1.3 卵子收集及体外受精 患者穿刺获得卵冠丘复合物(OCCCs),在体式显微镜下收集并识别卵子，OCCCs孵育2～4h，将优化后精子加至OCCCs所在培养滴中，精子浓度为5000～10000条/卵。精、卵共孵育4～5h,剥除卵周颗粒细胞。观察到的明显第一极体或极体扁平或极体内嵌状态均视为成熟卵。常规授精精卵孵育4～6h，若所有卵子都没有第二极体则采用补救性胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，过夜观察原核情况，如观察到两原核(PN)则认为受精成功。获卵率=获卵数/HCG日直径大于14mm的卵泡数。MII卵率=成熟卵率/卵子总数；IVF 2PN率=2PN数/卵子总数；ICSI 2PN率=2PN数/成熟卵数。

1.4 胚胎培养及妊娠判断 取卵后的第3天进行胚胎形态学评分，胚胎评判标准：I级：卵裂球大小均匀，碎片<10%；II级：卵裂球大小均匀或略不均匀，碎片10%～20%；III级：卵裂球大小明显不均匀，碎片20%～50%；IV级：卵裂球大小严重不均匀，碎片在50%以上。I～III级胚胎均为可用胚胎，长效降调节方案采用新鲜胚胎移植，PPOS方案采用冻融胚胎移植，移植时应优先选择评分高的胚胎，胚胎移植后第14天，进行血清HCG检测，数值大于5IU/L为生化妊娠，第4周B超检查有胎心搏动即可确认为临床妊娠。卵裂率=2PN卵裂数/2PN数；优质胚胎率=来源2PN优质胚胎数/来源2PN卵裂胚胎数；可用胚胎率=可用胚胎数/卵裂胚胎数。

2 结 果

2.1 患者一般情况 共纳入患者478例，其中卵子正常组(对照组)364例，共获得卵子3150个，其中成熟卵子2945个;透明带表面毛刺状65例，共获得卵子430个，成熟卵子368个;表面光滑的卵子49例，共获得卵子270个，成熟卵子199个。异常透明带组的平均年龄、体质量指数、原发和继发不孕比例、基础内分泌、AMH，HCG日P、LH水平，Gn剂量和天数，促排卵方案，与正常组比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。表面光滑的异常透明带组的不孕年限、扳机日E2水平低于其他两组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 临床特征比较

2.2 患者取卵、受精、胚胎情况 卵子正常组的获卵率最高，透明带表面光滑组获卵率最低，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；正常组的获卵数显著高于其两组(P<0.01)，其中表面毛刺状比光滑透明带获卵数略高，但差异无统计学意义(P﹥0.05)；3组补救ICSI率相比，差异有统计学意义(P=0.000)；正常卵子组的正常受精率、异常受精率、卵裂率与透明带表面光滑组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；正常卵子组的优质胚胎率最高，卵子表面光滑组最低，3组组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。正常卵子组的平均移植胚胎数较其他两组低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 取卵、受精和胚胎质量比较

2.3 患者妊娠结局 正常卵子组的生化妊娠率最高，卵子表面光滑组最低，3组组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；正常卵子组的临床妊娠率最高，卵子表面光滑组最低，3组组间差异有统计学意义(P<0.01)；正常卵子组种植率最高，与透明带表面光滑组比较有统计学意义(P<0.05)，透明带表面毛刺状组与透明带表面光滑组比较无统计学意义(P﹥0.05)。见表3。

表3 妊娠结局分析

3 讨 论

研究报道，人类IVF中卵子透明带异常发生率2%～5%[2]。在临床工作中，通常可观察到不同类型的透明带异常现象，如透明带不规则，暗色或棕色透明带，双透明带等。透明带由多种糖蛋白构成，主要是ZP1、ZP2、ZP3、ZP4四种蛋白，其中透明带的任一种蛋白缺失,都可能导致透明带结构和形态的异常,甚至影响卵子发育、精子的顶体反应，导致受精失败[3-4]。ZP蛋白异常也可能直接反映卵母细胞成熟缺陷[5]。研究报道，ZP2敲除的小鼠中，卵泡早期ZP1和ZP3蛋白是可以被合成，并相互交联组装为一层更薄的透明带，但卵子不能受精[6]。同时透明带成分和超微结构异常也可导致卵子不受精[7]。本文中异常透明带卵子与正常卵子在镜下观察透明带形态上致密透亮，似“蜡样”变性，表面呈放射状或光滑状，并表现卵子成熟率低、不受精现象，而透明带表面光滑组卵子变性更严重，均出现不受精，可能与透明带结构发生异常改变有关。2012年报道[8]了3例患者卵子透明带形状不规则、质地呈胶冻状,类似于本研究中的卵子形态，通过透明带糖蛋白的免疫荧光染色，考虑ZP3存在缺陷的可能，但在透明带试验中表现出正常的精子结合能力，因此并不认为该种透明带的异常是由于基因的遗传改变所致。

卵母细胞的微绒毛与透明带相互渗透,形成缝隙连接,从而使壁层颗粒细胞、卵丘细胞、卵母细胞共同形成一个结构上和功能上的合胞体，卵子通过微绒毛与穿过透明带的卵泡细胞微绒毛形成连接而进行物质交换,为正常卵子的发育、成熟以及透明带提供营养物质和调节信号[9]。本研究中放射冠颗粒细胞缺如，多数透明带薄，密度较高,可能不利于卵泡细胞微绒毛经过透明带到达卵黄膜表面,从而影响卵子的发育。雌激素的产生是LH和卵泡膜细胞LH受体结合后，使胆固醇合成睾酮和雄烯二酮。FSH和颗粒细胞上FSH受体结合，激活芳香化酶，将进入到颗粒细胞内的睾酮和雄烯二酮转化为雌激素E2和E1,再进入血液循环和卵泡液中。本研究结果显示，透明带表面光滑组患者取卵手术获卵率和HCG日雌激素较其他两组低，可能是由于卵子周围颗粒细胞缺如，失去与卵子正常连接，表面光滑透明带组表现更为严重，有的甚至近似裸化卵子，因此可能导致在取卵抽吸过程中卵子丢失。另一方面由于部分颗粒细胞缺失，与透明带失去正常连接，可能影响颗粒细胞的正常功能，导致无足够的雌激素分泌。本研究正常组和异常透明带组的患者年龄、体质量指数及各类不孕原因比例并无统计学意义，但异常组的AMH偏低，且较其他两组不孕时间长。表明不孕患者卵巢功能可能受到某种因素长期刺激，使卵巢内环境或卵巢功能改变，导致透明带变性。类似于本研究中的卵子，有研究认为[10]，透明带异常与促排卵方案关系不大，患者更换方案后仍出现异常类似现象，表明可能与遗传基因有关。

不同的透明带异常情况可能导致不同的结局。文献报道，颜色异常卵子，如暗色透明带，可能降低受精率、种植率和妊娠率[11]。透明带形态异常与IVF胚胎植入率、临床妊娠率、出生率等降低有关[12]。本文中的异常透明带卵母细胞在IVF中并不多见，除了共同的特征透明带致密透亮、卵周间隙小外，一种透明带表层呈毛刺状，部分卵周间隙较小，另一种表面较光滑，几乎所有卵子间隙极小，第一极体不明显呈扁平或镶嵌状。Esfandiari等[13]报道了1例类似的透明带形状异常女性通过ICSI治疗获得成功受精、胚胎发育和妊娠。因此建议不要丢弃具有极端形态异常的卵母细胞，因为ICSI可克服受精和卵裂的障碍。2013年国内外同时报道了一种类似的透亮致密的卵子[14-15]，取卵较困难，低受精能力，只有通过ICSI改善其受精，但不能改善其妊娠结局。

2014年报道的窄卵周隙卵子[16]，主要表现为卵母细胞周围颗粒细胞较少，近似裸卵，卵母细胞透明带玻璃样，极体扁平或不可见，ICSI时易破膜，无抵抗，注射后与正常卵母细胞相比，无皱褶产生，但几乎没有卵子退化，这与本研究中卵子一致。结果显示，卵子低成熟率，多数常规不受精和低妊娠率。2015年报道的透明带呈锯齿状[17]，卵子成熟度低，妊娠率低，但ICSI后正常受精率没有区别。以上报道与本研究结果一致，但没有区分透明带表面的形态。本研究结果显示，两组异常卵子低成熟率、高受精障碍率、低妊娠率，其中透明带表面光滑组结局更差，所有卵子均不能受精，尽管行补救性ICSI后受精情况有所改善，但胚胎质量和临床妊娠仍不尽如意。本研究中，透明带异常的两组共15例婴儿出生，随访过程中暂未发现身体结构、功能或代谢异常等出生缺陷，与正常组相比并无差异。初步表明透明带异常患者一旦获得妊娠，对子代健康并无明显影响。但样本量小，随访年限短，需进一步增加样本量进行远期随访。

总之，在IVF中“蜡样”透明带的卵子发育较差，形成的胚胎质量较差，最终导致优质胚胎率和妊娠率过低。这类的卵子、胚胎质量较差，较难形成囊胚，故建议选择卵裂期胚胎进行移植。因“蜡样”透明带的卵子常规IVF后精卵不结合，表面呈毛刺状的卵子采用ICSI助孕可以有效改善卵母细胞受精，使部分患者获得妊娠，但是表面光滑、无卵周间隙、极体不明显的卵子采用ICSI后并不能改善其胚胎质量和妊娠结局。本研究由于伦理限制，其形成原因和机制需进一步研究；且病例数量有限，时间跨度较长，需增加样本量或多中心对照研究。