共同性外斜视患儿眼外肌中IGF-1、AnxA1表达及与病理特征的关系

李 威，侯文文，李 影，章志扬

共同性外斜视是眼科常见斜视类型，危害大，发病率高，影响双眼视觉形成及发育，是引起儿童双眼视功能障碍的重要原因，同时有碍外观，影响患者身心健康[1]。共同性外斜视发病机制复杂，多认为与先天及解剖因素等有关[2]。既往研究多集中于眼外肌病理改变方面，包括眼外肌本体感受器、组织间质成分改变等[3]。最新研究发现，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)可调控蛋白肌酶信号传导，影响肌卫星细胞增殖、分化，促进肌纤维蛋白合成，修复肌细胞损伤[4]。动物研究认为，外源性补充眼外肌IGF-1可扩大肌纤维横截面积，提升肌肉收缩力[5]。LEIKINA等[6]报道，肌卫星细胞静止、活化期均可出现膜联蛋白A1(AnxA1)表达，促进肌卫星细胞迁移，并参与骨骼肌修复过程。推测IGF-1、AnxA1均可能通过调节眼外肌活化肌卫星细胞等途径影响眼外肌组织特性及生物学功能。为探究共同性外斜视眼外肌IGF-1、AnxA1表达情况及其与病理特征的关系，本研究检测共同性外斜视与非共同性外斜视患者眼外肌IGF-1、AnxA1表达情况，并探讨其与病理特征的关系，以期为共同性外斜视病理机制的研究提供参考。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2016年1月—2019年12月我院收治的共同性外斜视患儿53例(82眼)作为斜视组。纳入标准：年龄3～14岁；符合共同性外斜视诊断标准[7]；有手术指征，至少接受一条内直肌缩短术治疗；留存内直肌标本；无眼球运动障碍；第一、二斜视角相同；斜视度50～140△；临床资料完善。排除标准：有眼部外伤史、手术史者；有家族遗传史者；内直肌麻痹者；合并神经系统疾病者；颅面异常者；伴其他视觉缺陷疾病或眼病者；严重屈光不正、重度弱视或屈光参差者；伴其他器质性病变者；已接受斜视矫正者。斜视组男23例(32眼)、女30例(50眼)；年龄3～14(7.12±2.21)岁；病程1～6(3.76±1.21)年；斜视度(83.51±15.57)△。另选取同期行眼球摘除或角膜移植获得内直肌的正常眼位患儿30例(30眼)作为对照组，其中男12例(12眼)、女18例(18眼)；年龄3～13(7.06±2.19)岁。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准执行。

1.2观察指标 ①比较2组眼外肌IGF-1、AnxA1表达；②观察2组眼外肌组织病理改变，记录肌纤维排列异常率、Z线异常率、单位面积内线粒体数目、肌纤维截断面积；③分析共同性外斜视患儿眼外肌IGF-1、AnxA1表达与病理特征及斜视度的关系。

1.3标本取材与保存 共同性外斜视患儿入院均行常规眼科检查，常规行内直肌缩短术治疗，术中截取非注视眼内直肌附着点后5 mm×5 mm眼外肌，液氮冻存备用。同样方法取对照组内直肌冻存备用。

1.4免疫组织化学染色法测定IGF-1、AnxA1水平 IGF-1、AnxA1检测采用免疫组织化学染色法，试剂盒均购自美国Sigma公司。眼外肌蜡块连续切片(3 μm)，脱蜡至水，60 ℃温箱烘烤24 h，二甲苯脱蜡3次，每次5 min，100%、95%、75%乙醇脱水各2 min，自来水冲洗，蒸馏水浸泡2次，每次5 min，枸橼酸缓冲液浸泡热修复15 min，室温自然冷却，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3 min。3%过氧化氢去离子水孵育10 min，清除内源性过氧化物酶活性，磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次3 min。正常山羊血清封闭15 min，甩去多余液体，加兔抗IGF-1多克隆抗体(1︰50)/兔抗人AnxA1多克隆抗体(1︰300)，4 ℃湿盒内过夜。磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次3 min，滴入生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G，37 ℃孵育15 min，磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次3 min。加入辣根酶标记链霉卵白素，37 ℃孵育15 min，磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次3 min，加入显色剂显色5～10 min，蒸馏水浸泡洗涤10 min终止染色，苏木素复染，蒸馏水冲洗5 min，85%、95%、100%乙醇脱水各5 min，二甲苯透明，中性树胶封片。采用日本Olympus公司BH-2型光镜下拍照并观察，随机取5个高倍视野，观察肌细胞IGF-1、AnxA1阳性着色情况，以光镜下胞浆见棕黄色、棕褐色颗粒视为阳性，Image Pro Plus 6.0图像分析系统自动计算肌细胞IGF-1、AnxA1光密度值。

1.5肌组织病理改变观察 用显微手术剪将2组眼内直肌组织剪成2 mm×1 mm×1 mm大小，3%戊二醛固定，磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次15 min，四氧化锇固定2 h后重复洗涤3次，50%、70%、90%乙醇各脱水15 min，90%乙醇及90%丙酮1︰1混合脱水15 min，90%丙酮脱水15 min，100%丙酮脱水3次，每次15 min，环氧树脂混合液浸泡24 h，定向包埋，37 ℃过夜。45 ℃烘箱内烘烤12 h，60 ℃继续烘烤24 h，半薄切片定位，超薄切片机切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅染色。采用日本Olympus公司BX-40型透射电镜下观察并拍照，随机取3个高倍视野观察肌纤维、肌原纤维超微结构，采用德国OPTON Cooperation公司Image Analyzer图像分析软件测定肌纤维直径、肌纤维截断面积，计算肌纤维排列不规则比率、Z线异常率、单位面积内线粒体数目[8]。Z线模糊、扭曲或消失任一异常视为Z线异常，异常率=每视野异常Z线/每视野所测总Z线×100%。

2 结果

2.1IGF-1、AnxA1光密度值比较 斜视组IGF-1、AnxA1光密度值均低于对照组(P<0.01)，见表1与图1～2。

图1 是否患共同性外斜视2组患儿眼外肌IGF-1表达(SP×200)

表1 是否患共同性外斜视2组患儿眼外肌IGF-1、AnxA1光密度值比较

2.2眼外肌组织病理改变 光镜下可见斜视组患眼眼外肌肌纤维数量减少，肌丝破坏明显，伴局灶性肌丝溶解，肌纤维玻璃样改变，肌纤维结缔组织增生，伴不均匀纤维条索样变，间质成分增多，神经纤维数量减少，浆细胞变性、坏死，肌细胞核内移，伴大量线粒体聚集，肌丝排列紊乱，形态不规则，线粒体异常，呈空泡状，肌小节Z带不清晰或消失；光镜下可见对照组眼外肌均匀分布的肌纤维，排列规则、紧密、整齐，Z带清晰，群组化明显，无胶原组织增生。见图3。斜视组肌纤维排列异常率、Z线异常率及单位面积内线粒体数目均高于对照组，肌纤维截断面积小于对照组(P<0.01)。见表2。

表2 是否患共同性外斜视2组患儿眼外肌组织病理改变比较

图2 是否患共同性外斜视2组患儿眼外肌AnxA1表达(SP×200)

图3 是否患共同性外斜视2组患儿眼外肌光镜下病理图像(HE×400)

2.3共同性外斜视患者眼外肌IGF-1、AnxA1表达与病理特征及斜视度的关系 斜视组眼外肌IGF-1表达与AnxA1、肌纤维截断面积呈正相关(P<0.01)，与肌纤维排列异常率、Z线异常率、单位面积内线粒体数目、斜视度均呈负相关(P<0.01)；AnxA1表达与肌纤维截断面积呈正相关(P<0.01)，与肌纤维排列异常率、Z线异常率、单位面积内线粒体数目、斜视度均呈负相关(P<0.01)。见表3。

表3 共同性外斜视患儿眼外肌IGF-1、AnxA1表达与病理特征及斜视度的关系

3 讨论

既往认为，共同性外斜视患者在注视各方向时偏斜角度相同，眼外肌无明显器质性病变[9]。但随着研究不断深入，越来越多的报道指出，斜视、弱视侧眼外肌有明显病理变化，可出现间质成分增多、肌细胞减少、线粒体病变及肌丝破坏等肌源性损害和细胞结构变性等[10-11]。马晓梅等[12]研究发现，共同性外斜视患者外直肌光镜下有明显纤维萎缩性病变，眼外肌细胞结构直接影响斜视度及手术治疗效果。本研究发现，斜视组眼外肌普遍存在纤维变性，Z带分界欠清晰，肌纤维排列紊乱，线粒体数目增多，肌纤维排列异常率、Z线异常率、单位面积内线粒体数目上升，支持上述结论及国外报道[13]结果，与对照组肌纤维镜下特征有明显区别。提示共同性外斜视患者患侧眼外肌存在不同程度变性、退化，推测眼外肌肌纤维病理改变可能是产生外斜视的重要原因。共同性外斜视患者肌纤维发育不良、萎缩变性，肌纤维排列紊乱，线粒体供能不足，无法支撑眼内肌完成有效收缩，导致患侧眼外肌收缩能力减弱，对侧眼外肌肌力相对较强，双侧眼外肌肌力不平衡，故出现眼位偏斜。

共同性外斜视眼外肌肌纤维改变的确切机制尚未完全阐明。新近文献报道，肌卫星细胞功能与肌纤维改变存在紧密关联，而成肌调节因子及各类生长因子均影响肌卫星细胞增殖及分化，导致肌纤维结构及功能改变[14]。IGF-1为多功能细胞增殖调节因子，作为刺激因子可与其他细胞周期刺激因子协同促进细胞有丝分离；IGF-1亦属于合成类激素，可参与蛋白质、糖类、核酸等合成及代谢过程。多项研究证实，IGF-1参与了多种炎症性疾病、恶性肿瘤的发病过程[15-16]。王丽娜[17]开展的一项动物研究发现，IGF-1可刺激骨骼肌卫星细胞增殖，加速肌纤维收缩。汤志铮等[18]发现，IGF-1与受体结合可诱导晶状体上皮细胞增殖，参与白内障发病过程。王益丹[19]发现，实验猫内直肌注射IGF-1后肌卫星细胞数目较空白组增多，认为外源性补充IGF-1可改善肌纤维功能。本研究发现，斜视组IGF-1光密度值较对照组低，且与肌纤维排列异常率、Z线异常率、单位面积内线粒体数目、斜视度呈负相关，与肌纤维截断面积呈正相关。推测共同性外斜视患者眼外肌IGF-1表达下降会影响肌卫星细胞增殖、分化，降低患眼肌纤维修复能力，造成眼外肌肌纤维紊乱，肌纤维直径缩短，体积缩小，肌纤维萎缩，进一步影响眼外肌肌力，增加斜视发生风险。且随IGF-1降低，眼外肌损伤后修复能力弱化，肌力失衡，控制能力降低，斜视度增加，导致斜视进展。故认为IGF-1可能参与共同性外斜视发生与进展过程。

AnxA1属磷脂结合蛋白家族成员，介导抗炎及细胞黏附、迁移、增殖、分化等生物学过程。既往研究已证实AnxA1可抑制癌细胞增殖、分化[20]。近期有报道指出，AnxA1参与肌细胞膜修复过程，其局部水平升高可促进细胞膜融合[21]。付令利[22]体外实验发现，肌卫星细胞静止期与活化后均可表达AnxA1，尤其增殖、分化的肌细胞AnxA1表达水平较高。本研究发现，斜视组眼外肌AnxA1光密度值较对照组低，推测AnxA1参与眼外肌的修复过程。眼外肌AnxA1表达降低，导致肌卫星细胞增殖、分化能力降低，影响肌管形成及修复，造成眼外肌肌力失衡，导致共同性外斜视发生[23]。本研究还发现，共同性外斜视患者眼外肌AnxA1表达与肌纤维排列异常率、Z线异常率、单位面积内线粒体数目、斜视度呈负相关，与肌纤维截断面积呈正相关，推测AnxA1低表达可能导致肌卫星细胞活化数量减少，造成肌纤维萎缩变性，引起内环境改变，影响眼外肌自身修复，加重肌细胞萎缩变性及肌纤维排列紊乱，造成肌小节破坏及胶原组织增生，而上述病理变化均可能影响眼外肌收缩功能，造成眼外肌过度松弛、收缩力降低，诱发外斜视。

综上，共同性外斜视患儿眼外肌IGF-1、AnxA1表达较正常眼位儿童降低，二者表达下降可能通过影响肌卫星细胞活化等途径，引起肌纤维变性、坏死，影响眼外肌自身修复及收缩、控制功能，造成共同性外斜视。