猫须草水提物对两种急性高尿酸血症模型小鼠的降尿酸作用

符静泉，韦曼莉，韦明中，赵凯丽，黄纯莹，蒋伟哲，付书婕

(1.南宁市卫生学校，广西 南宁 530007；2.广西医科大学 药学院，广西 南宁 530021；3.贺州市人民医院，广西 贺州 542800)

高尿酸血症是一种患病率极高的疾病，由体内嘌呤代谢紊乱致血中尿酸水平异常升高所引起。高尿酸血症是代谢性疾病，更是诱发痛风的主要因素之一[1-2]。痛风的确切病因与发病机制尚未完全阐明，治疗手段主要为促进尿酸排泄和抑制尿酸合成以缓解其病情发展，不良反应较大，且胃肠道反应明显，患者常伴随肝肾功能损害。中药的不良反应较少，价格低廉，因此开发抗高尿酸的中药具有重要的价值[3-4]。

猫须草(Orthosiphon stamineus)，又名肾茶，为唇形科肾茶属多年生草本植物，因形态上其雄蕊和花柱伸出花冠外酷似猫须而得名，是我国傣族民间常用草药，傣族经典医学著作《贝叶经》《档哈雅》对其临床应用有详细记载[5-6]。该属植物全世界仅有5种，而我国唯有一种，主要分布于广东、广西南部、海南、台湾、云南南部及福建等地[7]。目前，关于猫须草抗高尿酸血症作用的研究报道较少，本研究分别注射次黄嘌呤溶液和灌胃氧嗪酸钾盐的方法建立两种急性高尿酸血症动物模型，初步探讨猫须草的降尿酸作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级KM小鼠120只，雌雄各半，体质量18～22 g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK桂2014-0003。

1.1.2 药物 猫须草(Clerodendranthusspicatus(Thunb.) C.Y.Wu ex H.W.Li)(南宁市生源中药饮片有限责任公司，干燥保存)；别嘌醇片(广东彼得药业有限公司，批号20130803)；次黄嘌呤(上海源叶生物科技有限公司，批号TM0313XC13)；氧嗪酸钾盐(德国Sigma公司，批号12042001)。

1.1.3 试剂的配制 (1)猫须草水提物的制备：猫须草干燥枝叶粉碎得粗粉，取250 g，加蒸馏水10倍量，100 ℃水浴锅回流3次，每次进行1 h，合并3次回流所得滤液，减压浓缩至膏状，80 ℃电热恒温干燥箱干燥[8-9]，得提取物粉末质量为14.533 g，计算得率为5.81%；再将所得提取物按剂量用蒸馏水溶解即配制成灌胃给药的猫须草水提物(OSE)。

(2)供试品溶液的配制：取猫须草水提取物5 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加入无水甲醇，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得0.5 mg/mL供试品溶液。

(3)对照品溶液的配制：取咖啡酸对照品15 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶，加入无水甲醇，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得1.478 mg/mL咖啡酸对照品溶液。取迷迭香酸对照品20 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶，加入无水甲醇，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得1.95 mg/mL迷迭香酸对照品溶液。精密量取1 mL、1.478 mg/mL咖啡酸对照品溶液和1 mL、1.95 mg/mL迷迭香酸对照品溶液，置于25 mL容量瓶，加入无水甲醇，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得咖啡酸与迷迭香酸混合对照品溶液(咖啡酸浓度为0.059 15 mg/mL，迷迭香酸浓度为0.078 mg/mL)。

1.1.4 仪器 万分之一天子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司，型号：EL204型)；百分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司，型号：EL602型)；恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司，型号：WB-2000)；高速低温离心机(赛默飞世尔科技有限公司，型号：Micro CL17R)；全自动生化分析仪(HITACHI日立集团，型号：日立7100)；无菌操作台(长沙米淇仪器设备有限公司，型号：1334)；旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司)；粉碎机(上海鼎广机械设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 120只KM小鼠按性别、体质量使用Excel软件区组分层随机分组法随机分为12组，每组10只，次黄嘌呤组小鼠和氧嗪酸钾盐组小鼠各60只，分别为空白组，模型组，OSE高、中、低剂量组，别嘌醇组。次黄嘌呤组小鼠第7天灌胃给药后1 h，除空白组腹腔注射等体积生理盐水外，模型组与各给药组小鼠腹腔注射次黄嘌呤溶液(50 mg/mL)10 mL/kg，同时撤去饲料，禁食不禁水；氧嗪酸钾盐组小鼠给药的7 d内，每日上午9时分别灌胃给予模型组及各给药组氧嗪酸钾盐(250 mg/kg)。

1.2.2 给药方法 每日上午10时灌胃1次，每次给药10 mL/kg。经查阅文献及中医处方，并由体表面积换算，设高、中、低给药剂量分别为3 000 mg/kg、1 500 mg/kg、750 mg/kg。空白组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，别嘌醇组以别嘌醇药液(5 mg/kg)灌胃给药。OSE高、中、低剂量组分别用OSE药液灌胃给药，连续灌胃7 d。

1.2.3 检测指标与方法 (1)猫须草水提取物中咖啡酸与迷迭香酸的检测：色谱柱：Kinetex© C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；以乙腈-0.1 %磷酸水溶液(15∶85)为流动相；体积流量为1.0 mL/min；进样量为10μL；柱温为25 ℃；检测波长为340 nm；图谱采集时间为80 min。理论塔板数以咖啡酸和迷迭香酸计算均不低于3 000，分离度均大于1.5。

(2)指标测定：次黄嘌呤组造模后半个小时，去眼球采血；氧嗪酸钾盐组第7天给药后1 h，去眼球采血(采血前12 h禁食不禁水)1.0 mL～1.5 mL，常温静置1 h后，于4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取血清，于HITACHI7100生化分析仪测定血清尿酸(SUA)、血清肌酐(SCr)和血清尿素氮(BUN)含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 含量测定结果

由图1和图2可见对照品及供试品色谱图，采用外标法对OSE主要成分中的咖啡酸及迷迭香酸进行含量测定。可知咖啡酸对照品峰面积(A1)为1 027.756 10，咖啡酸样品峰面积(A2)为1 259.717 96，迷迭香酸对照品峰面积(A3)为2 902.996 02，迷迭香酸样品峰面积(A4)为2 771.667 36。咖啡酸对照品浓度(C1)为0.059 15 mg/mL，迷迭香酸对照品浓度(C3)为0.078 mg/mL。由此计算咖啡酸样品浓度C2为0.072 5 mg/mL，迷迭香酸样品浓度C4为0.074 5 mg/mL。换算为猫须草生药含量为：样品中咖啡酸的生药含量为8.424 5 mg/g；样品中迷迭香酸的生药含量为8.645 69 mg/g。

图1 咖啡酸与迷迭香酸对照品混合溶液HPLC色谱

图2 猫须草水提溶液HPLC色谱

由表1可见，与空白组比较，模型组SUA、SCr和BUN水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，说明实验造模成功，实验具有可靠性。与模型组相比，别嘌醇组能大幅度降低USA、SCr和BUN含量，差异有统计学意义(P<0.01)，说明别嘌醇对次黄嘌呤致小鼠急性高尿酸血症具有干预作用。OSE高、中剂量组不同程度地降低USA、SCr和BUN含量，差异均具统计学意义(P<0.01或P<0.05)，其中高剂量组与空白组最为接近，其效果最明显。

表1 OSE对次黄嘌呤致急性高尿酸血症小鼠血清SUA、SCr和BUN水平的影响

2.2 OSE对氧嗪酸钾盐致小鼠急性高尿酸血症的作用

由表2可见，与空白组比较，模型组SUA、SCr和BUN水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，说明实验造模成功。与模型组相比，别嘌醇组能大幅度降低SUA、SCr和BUN含量，差异有统计学意义(P<0.01)，说明别嘌醇对氧嗪酸钾盐致小鼠高尿酸血症具有干预作用。OSE高剂量组降低SUA、SCr和BUN含量，差异具统计学意义(P<0.01或P<0.05)；但OSE中和低剂量组对SUA的作用不明显(P>0.05)，差异不具有统计学意义。

表2 OSE对氧嗪酸钾盐致急性高尿酸血症小鼠血清SUA、SCr和BUN水平的影响

3 讨论

高尿酸血症是痛风的病理基础，当体内尿酸达到一定浓度就会形成尿酸盐沉积到肾脏和关节中，形成痛风。研究高尿酸血症的意义在于研究治疗痛风药物的作用机制[10]。次黄嘌呤是尿酸的前体物质，能被黄嘌呤氧化酶催化为尿酸，目前已经广泛用于急性高尿酸血症的模型建立。本实验采用昆明小鼠腹腔注射次黄嘌呤建立急性高尿酸血症模型，其优点在于一次给药即可使模型小鼠SUA浓度持续升高较长时间，已有文献发现，腹腔注射500 mg/kg的剂量进行急性高尿酸血症模型的建立具有SUA水平升高迅速、维持时间长、器官损伤小等特点[11]。结果显示模型组SUA水平显著升高，提示模型复制成功。别嘌醇虽然能大幅度降低小鼠SUA，但SUA水平低于空白组，表明副作用比较大。OSE高、中剂量组均能显著降低急性高尿酸血症小鼠SUA，说明OSE对治疗痛风疾病具有良好的效果，且安全性能高。

尿酸氧化酶能使尿酸迅速氧化催化成为过氧化氢及尿囊酸等物质，不再被肾小管吸收而排出体外。氧嗪酸钾盐作为尿酸氧化酶抑制剂，能抑制尿酸分解，从而升高体内尿酸水平[12]。本实验采用昆明小鼠连续7d灌胃给予氧嗪酸钾盐的方法建立急性高尿酸血症模型，结果SUA显著升高，提示模型复制成功。别嘌醇组和OSE高剂量组能显著降低急性高尿酸血症小鼠SUA，说明OSE高剂量组对治疗高尿酸血症具有良好的效果。

据国内外研究，猫须草已分离鉴定出200多种化学成分，主要包括黄酮类、酚类、二萜类、三萜类、精油等成分[13]，而其抗氧化、利尿、抗炎和抗慢性肾衰竭等药理作用与其所含迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸、黄酮类、肌酐等有关。咖啡酸具有极强的抗氧化能力和DPPH氧自由基清除能力[14]。迷迭香酸具有抗炎、抗氧化、降尿酸和抑制黄嘌呤氧化酶等作用[15-18]。因此，OSE的降尿酸机制可能与其主要成分咖啡酸、迷迭香酸的抗炎和抑制黄嘌呤氧化酶作用有关，本课题组在后续研究中，将进一步探索OSE的有效成分及降低高尿酸血症尿酸水平的作用机制。