盐酸苯海拉明咖啡因复方的遗传毒性评价

侍雯婧，张吉芊竹，#，朱江波，张晓芳，王瑞娜，戴小宇，任丽君，田逸君，*

(1．海军军医大学卫生毒理学教研室，上海 200433；2．海军军医大学药学系，上海 200433)

晕动病(motion sickness)，也称为运动病，即指人们日常说的“晕车、晕船、晕机”等，是由多种因素导致人体对运动状态错误感知的一系列生理反应。常见于乘坐交通工具时，症状主要有头晕、恶心、呕吐、上腹部不适、面色苍白、出冷汗等，严重的可能会导致冷漠、抑郁，甚至导致认知和运动能力下降[1-2]。该病的发病机制复杂，目前尚未形成统一的诊治规范，仍以药物治疗为主[3]。相关研究表明苯海拉明对中枢神经系统有抑制作用，可产生镇静和嗜睡等抑制作用，从而快速改善眩晕发作[4]。咖啡因是一种存在于各种植物中的天然生物碱，是消费最广泛的兴奋剂之一。这两种药物对处于抑制状态的中枢神经尤其有效，对心血管系统具有正性作用，还能促进胃酸分泌及治疗偏头痛等疾病，并在机体的多个系统中发挥广泛的作用[5]。Crawford等[6]通过系统回顾有关含咖啡因的食品和饮料对健康成年人大脑认知功能影响的研究发现，咖啡因补充剂能够改善睡眠不足者的认知功能，如提高注意力和警惕性，缩短对复杂情况的反应时间以及提升解决问题和推理问题的能力。考虑到苯海拉明抗晕动症的同时有中枢抑制的副作用。药物组成复方一直是临床上用于增强药物疗效、降低药物不良反应的常用方式。因此通过将苯海拉明与咖啡因组成复方，在发挥苯海拉明抗晕动症作用的同时，利用咖啡因降低嗜睡反应的发生率。迄今为止，国内外未见有关盐酸苯海拉明咖啡因复方安全性评价方面的研究报道。为提高临床用药的安全性，本试验采用Ames试验、体外培养中国仓鼠肺细胞(Chinese hamster lung cells，CHL)染色体畸变试验和ICR小鼠骨髓微核试验对盐酸苯海拉明咖啡因复方进行了遗传毒性检测，为盐酸苯海拉明咖啡因复方的临床合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 盐酸苯海拉明咖啡因复方盐酸苯海拉明为N，N-二甲基-2-(二苯基甲氧基)乙胺盐酸盐(500 g/袋，批号DH-201812104)，由海军军医大学药学系提供，白色结晶性粉末，无臭，干燥、阴凉保存，结构式见图1。咖啡因为1,3,7-三甲基-3,7-二氢-1H-嘌呤-2,6-二酮一水合物或其无水物(1 000 g/袋，含量为99.8%，批号16112112)，由海军军医大学药学系提供，白色有丝光的针状结晶，无臭，室温、干燥、密封保存，分子结构式如图2。经前期文献[7]调研，分别查阅了苯海拉明和咖啡因单独应用的安全性相关文献[8-14]。苯海拉明和咖啡因在临床常用剂量(苯海拉明12.5～25 mg，咖啡因50～200 mg)下安全。依据小鼠和大鼠药理学实验的结果，确定苯海拉明咖啡因复方的药物组成为苯海拉明∶咖啡因=25 mg∶60 mg。药效学研究的多次实验结果显示该配比组成在发挥苯海拉明抗晕动症作用的同时，咖啡因降低了嗜睡反应的发生率，效果比较理想。

图1 盐酸苯海拉明结构式[15]1 000

图2 咖啡因结构式[15]649

1.1.2 CHL细胞及大鼠肝微粒体酶S9CHL细胞购自于上海中乔新舟生物科技有限公司。S9购自美国Moltox公司，批号4144；规格2 mL/支；有效期至2021年12月12日；-80℃保存。代谢活化系统是S9和辅助因子的混合物，临用前新鲜配制。

1.1.3 动物SPF级ICR小鼠共60只，每组10只，雌雄各半，5～7周龄，雌鼠体质量21.7～25.1 g；雄鼠体质量23.5～26.8 g，源自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，实验动物合格证号2018006019883。

1.2 试验方法

按最新的《药物遗传毒性研究技术指导原则》[16-17]的设计要求，分别应用Ames试验[18]、体外培养CHL细胞染色体畸变试验[19]和ICR小鼠骨髓微核试验[20]检测盐酸苯海拉明咖啡因复方的遗传毒性。检测终点覆盖了基因突变和染色体损伤。

1.2.1 Ames试验组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535共5个菌株，均购自美国Moltox公司。所用菌株均已进行了R因子、组氨酸缺陷型等鉴定，结果表明本试验所用的各种菌株基因型均合格。Ames试验受试物的最高浓度主要取决于受试物对细菌的毒性和溶解度。对不受溶解度或细胞毒性限制的受试物，应达到的最高浓度为5 mg/皿[9]，故设盐酸苯海拉明咖啡因复方总剂量为0.5、5、50、500、5 000 mg/皿共5个剂量组，此外设空白对照、溶媒对照和阳性对照组(见表1)，每皿均加入相应浓度的供试品溶液0.1 mL。采用标准平板掺入法，使细菌在加和不加S9(大鼠肝微粒体酶S9匀浆4 mL、0.2 mol/L pH=7.4的PBS 50 mL、MgCl2-KCl溶液2.0 mL、1 mol/L 6-磷酸葡萄糖溶液0.5 mL、0.1 mol/L NADP/辅酶Ⅱ4.0 mL、无菌去离水17.5 mL)的条件下接触受试物，每皿均加入供试品、溶媒对照(超纯水)或阳性对照物0.1 mL，加S9组在每个平皿的试验体系中加入0.5 mL的S9混合液，不加S9组在每个平皿的试验体系中加入0.5 mL的PBS。每个剂量组及对照组均平行设3个皿。采用最低极限(能使组氨酸缺陷型菌株长成菌落所需的最小浓度的组氨酸琼脂平板)的组氨酸琼脂培养基培养48 h后，先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况，确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用，再人工计数每皿回复突变的菌落数，并计算每组的均值和标准差，与溶剂对照组进行比较。

表1 Ames试验阳性对照品及其浓度(100μL/皿)

1.2.2 体外培养CHL细胞染色体畸变试验染色体畸变预试验最高浓度为0.5 mg/mL，溶解受限时，以受试物在溶媒中的最大溶解度为最高浓度，再按等比级数设计若干个浓度[9]。通过预试验测定供试品盐酸苯海拉明咖啡因复方的IC50。本次预试验结果IC50为33.8 mg/mL。故在加和不加S9(S92.0 mL、HEPES 6.3 mg、MgCl2·6H2O 6.9 mg、KCl 16.4 mg、6-磷酸葡萄糖10.1 mg、70%NADP 27.3 mg、无菌去离子水4.6 mL)的条件下，体外培养的CHL细胞中加入相应浓度的低(8.45 mg/mL)、中(16.9 mg/mL)、高(33.8 mg/mL)剂量组供试品，反应体系总体积为6 mL。另设溶媒对照组、阳性对照组，每组均设2个平行样品。阳性对照：-S9时用0.5 mg/mL丝裂霉素C，+S9时用60 mg/mL环磷酰胺。药物作用分别于细胞4 h后弃去原培养基加入新鲜培养基继续培养至24 h，或作用于细胞24 h后收集细胞。终止培养前4 h，加入20 mg/mL秋水仙碱60 mL，培养结束收集细胞，经离心、低渗处理后，再进行固定、离心、制片得细胞染色体玻片，镜检前用刘氏染液染色，每个剂量组制备2～4张玻片标本。

镜检时每组观察300个分散良好并且数目完整的中期分裂相细胞染色体(若观察到大量畸变染色体，如阳性对照组，分析染色体数可相应减少为100个)。分别记录各组含有结构畸变染色体的细胞数和畸变类型(计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目)，裂隙单独记录，但不计入畸变率中。同时单独记录多倍体和核内复制等数目畸变，均不计入畸变率中。计算每组的染色体畸变率。

1.2.3 ICR小鼠骨髓微核试验检疫期结束后对小鼠称量体质量并按随机区组法分成6组，根据ICR小鼠单次给药毒性试验结果，供试品盐酸苯海拉明咖啡因复方LD50为172.7 mg/kg。本次试验以1/2 LD50为最高剂量，其他剂量按等比级数设置，分别为上一个剂量的1/2[9]。故 设 低(21.59 mg/kg)、中(43.17 mg/kg)、高(86.35 mg/kg)剂量组小鼠经口灌胃，其中高剂量组设两组，分别在药物作用24 h和48 h后处死，并设阳性对照(40 mg/kg环磷酰胺腹腔一次注射，给药容量为10 mL/kg)和溶剂对照组(经口灌胃超纯水)，给药容积为15 mL/kg。除高剂量48 h组外，其他组均在药物作用24 h后处死。取股骨制备骨髓涂片，每只小鼠制2张骨髓片，自然干燥后，取刘氏染液A液和B液，按2∶1混匀配制成应用液，均匀铺于玻片表面，染色1～2 min后用清水冲洗掉玻片上的染色液，自然晾干。

每只动物镜检约4 000个骨髓嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes，PCE)，计数含微核的PCE数，计算微核发生率，同时至少计数500个骨髓红细胞以确定嗜多染红细胞(PCE)与正染红细胞(normochromatic erythrocytes，NCE)的比例，评价受试物是否有骨髓毒性。

1.3 统计学方法

Ames试验结果的评价是以比较给药组与溶剂对照组的回复突变菌落数为基础，若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组的2倍以上，呈现可重复性，并在一定的剂量范围内存在着剂量-反应关系，则判断为阳性[11]；CHL细胞染色体畸变试验和ICR小鼠骨髓微核试验均采用卡方检验比较给药组与溶媒对照组之间的差异是否具有统计学意义[12-13]。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 Ames试验结果

所有平皿经观察均未见杂菌污染，并可见背景目标菌苔生长。5个菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照诱发的回复突变菌落数均在历史对照范围内，并且阳性对照组与空白对照组相比回复突变菌落数显著增加，提示本试验系统符合试验要求。在受试物最高剂量达到5 000 mg/皿的受试条件下，未观察到盐酸苯海拉明咖啡因复方的抑菌现象。各剂量组受试物在加和不加S9时物种菌株所诱发的回复突变菌落数均与自发的突变菌落数相近，并且未观察到明显的剂量-反应关系。结果见表2。

表2 盐酸苯海拉明咖啡因复方的Ames试验回变菌落数(个/皿，±s)

表2 盐酸苯海拉明咖啡因复方的Ames试验回变菌落数(个/皿，±s)

组别受试物0.5 mg/皿5 mg/皿50 mg/皿500 mg/皿5 000 mg/皿空白对照组溶剂对照组阳性对照组TA97+S9 59±1 53±8 69±3 65±9 69±13 63±23 63±12 680±72-S9 64±6 57±3 58±7 60±5 59±11 60±9 56±6 630±48 TA98+S9 17±2 17±2 16±2 29±7 25±6 23±3 23±6 847±46-S9 16±2 14±2 18±2 23±4 26±3 25±9 19±3 1 019±162 TA100+S9 98±2 129±22 116±28 104±17 110±19 118±33 113±15 785±224-S9 93±13 107±3 113±12 94±24 115±12 119±9 115±17 854±54 TA102+S9 147±12 173±58 163±57 183±53 178±46 171±20 179±32 1 028±82-S9 172±41 190±56 194±23 159±37 179±22 171±36 197±28 970±32 TA1535+S9 17±2 12±4 11±2 9±3 12±4 18±1 21±5 453±30-S9 17±1 14±4 10±4 10±2 12±4 12±3 16±4 452±22

2.2 体外培养CHL细胞染色体畸变试验结果

见表3。经显微镜观察阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率显著增高，与溶剂对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)；盐酸苯海拉明咖啡因复方各剂量组的CHL细胞染色体畸变率与溶剂对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)，结果为阴性。

表3 盐酸苯海拉明咖啡因复方的体外培养CHL细胞染色体畸变试验结果

2.3 ICR小鼠骨髓微核试验结果

见表4。盐酸苯海拉明咖啡因复方各剂量组小鼠在给药后未见异常，且未出现动物死亡。盐酸苯海拉明咖啡因复方不同剂量下雌、雄小鼠骨髓细胞中PCE/(PCE+NCE)＞50%，未观察到对小鼠骨髓的抑制作用，各剂量组微核率与溶剂对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。提示盐酸苯海拉明咖啡因复方小鼠骨髓微核试验结果为阴性。

表4 盐酸苯海拉明咖啡因复方的ICR小鼠骨髓微核试验结果(n=5)

3 讨论

本研究采用的是遗传毒性研究经典的试验组合，这3个试验分别从体外到体内，从微生物、离体细胞和整体动物水平上评价药物的遗传毒性，是最新的《药物遗传毒性研究技术指导原则》推荐的标准试验组合[16-17]，体外试验中包含了加与不加代谢活化系统，能检测基因突变、染色体畸变等多个遗传学终点，符合国际标准化的要求。随着新型药物的涌现以及对药物评价试验要求的不断提高，传统的试验体系也历经了一系列优化[21]。近几年受到普遍关注的流式细胞术检测体外微核[22]、彗星试验[23-24]，Pig-a基因突变试验[25]，作为逐渐被认可的遗传试验方法，让今后的遗传毒性测试方法组合增加了更多选择，使遗传毒性评价体系更加完善。

我们分别查阅了苯海拉明和咖啡因遗传毒性相关的文献。苯海拉明和氢氯噻嗪对TA98菌株有致突变作用[26]；盐酸苯海拉明在浓度达150或50 kg/mL时，未观察到细胞周期的延迟，无论是否加入S9，均未诱发染色体畸变。在高剂量(300 pg/mL)下，加S9组的染色体畸变试验在标准收获期为阴性，但计数少于100个中期细胞可被忽略。在最高剂量(含和不含S9)下，在一个18 h的实验中，产生染色单体断裂、三辐体和四辐体；在一个16 h的化学暴露和6 h的恢复期的实验中，X染色体上一个位点的染色体断裂数对阳性反应有显著影响[27]。苯海拉明急性毒性试验结果显示，经口小鼠LD50为160 mg/kg；腹腔内注射小鼠LD50为56 mg/kg；静脉注射小鼠LD50为20 mg/kg[28]。与此同时，有报道咖啡因急性毒性试验结果显示，经口给药时对小鼠、仓鼠、大鼠、兔的LD50分别为127、230、355、246 mg/kg(雄性)和137、249、247、224 mg/kg(雌性)[28]。咖啡因的致突变潜力已在低等生物中得到证实，大多数关于其诱导染色体损伤的数据是在浓度约为咖啡过量者预期剂量6～100倍的情况下获得的，并且通常比咖啡因对人体的估计致死剂量大几个数量级[29]。因此，饮用适量到正常量的咖啡和咖啡因诱发人类突变效应的可能性几乎是不存在的。有研究表明咖啡因及其衍生物和代谢物可在辐射引起的多种细胞和组织损伤中发挥抗氧化、化学预防和辐射防护作用，对化学诱导的癌变产生保护作用[30]。本次评价的药物是一类复方制剂，主要利用咖啡因兴奋作用与苯海拉明镇定作用的互补，以弥补苯海拉明因嗜睡产生的不适感觉。将这两种药物以一定比例混合而得的复方制剂属国内首创，且该类复方制剂的遗传毒性研究此前未见报道。综上所述，在本实验条件下盐酸苯海拉明咖啡因复方制剂的毒性小于单一样品。本研究结果提示盐酸苯海拉明咖啡因复方不具有遗传毒性和潜在致癌性，与相关的文献报道结论基本相符，本次研究对于其将来的应用及推广具有参考意义。