小柴胡汤对大鼠慢性氟中毒致肝损伤的保护作用Δ

陈伟杰，吴浪浪，彭玖燕，梁超男，贺廷贵，吴楚珍，唐文超

(1.贵州中医药大学第二临床医学院，贵阳500025； 2.贵州中医药大学第一临床医学院，贵阳 500025； 3.贵州中医药大学基础医学院，贵阳 500025)

地方性氟中毒是因为人们长期生存在较高浓度氟暴露下，通过饮水、空气和食物等媒介过量摄入氟化物而致全身慢性积累性中毒，即慢性氟中毒[1]。研究结果表明，氟中毒可造成骨相损害，其典型临床症状为氟斑牙与氟骨症[2]。研究者发现，氟化物还可对非骨相系统造成严重的损害，如肝脏等[3]。蔡宇等[4]在慢性氟中毒对大鼠肝、肾组织中Nrf2基因表达影响的研究中指出，氟导致肝、肾损伤与氧化应激反应有着密切的关系。氟中毒的防治目前暂无特效药，但近年来有关中医药拮抗氟中毒所致危害成为研究的热点[5]。王飞清等[6]采用不同剂量天冬灌胃治疗氟中毒大鼠，结果显示，大鼠抗氧化能力得到提升，有效缓解了氟中毒带来的损伤。小柴胡汤源于汉代张仲景所著《伤寒杂病论》，为中医十大名方之一。药理研究结果显示，小柴胡汤具有抑制炎症、抗氧化、调节免疫、抗肝纤维化以及调节内分泌等功能[7]。相关研究结果已证实氟中毒导致肝损伤的作用机制主要与氧化应激密切相关[8-9]。小柴胡汤可通过抗氧化等作用缓解氧化应激所引起的肝损伤[10]。也有研究结果发现，小柴胡汤对肝损伤有很好的保护作用，其作用机制可能与所含中药提取物的抗氧化及清除自由基等作用有关[11-12]。因此，本研究旨在观察小柴胡汤对慢性氟中毒所致肝损伤的保护作用，并探讨其是否通过抗氧化作用进而抑制氧化应激达到保护肝的作用，为地方性氟中毒的预防和治疗提供重要的理论基础，也为传统中药小柴胡汤提供更广阔的应用空间。

1 材料

1.1 动物

健康雄性SD大鼠40只，体重(200±5)g，购自长沙市天勤生物技术有限公司[许可证号：SCXK(湘)2019-0014]。饲养于动物设施中，温度为(25±2)℃，湿度为(60±1)%，暗/光周期为12 h，所有大鼠均喂以标准饲料和干净的水。

1.2 仪器

RM2245型石蜡切片机(德国Leica公司)；KD-BM型石蜡包埋仪(上海卓的仪器设备有限公司)；ChemidocTMXRS型恒温水浴锅(河南省艾瑞德仪器设备有限公司)；0180511086型分析天平(上海力辰仪器科技有限公司)，FORMA8800型-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；DP73+standard型光学显微镜(CCD照相系统)；C21-WK2102型微波炉(广东美的电器股份有限公司)；75004250型高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)；ISKANMK3型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；F10型匀浆机(美国Dremel公司)。

1.3 药品与试剂

柴胡、半夏、黄芩、生姜、党参、大枣和甘草均购自贵州一品药业有限公司；氟化钠购自天津科密欧化学试剂有限公司(NaF，分析纯，批号：CB/T 1266-2006)；0.9%氯化钠溶液购自广州美缇生物科技有限公司。苏木精-伊红(HE)染色、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)等试剂盒均购自南京建成生物有限公司。

2 方法

2.1 药物制备

小柴胡汤组方为：柴胡24 g，黄芩9 g，党参9 g，炙甘草9 g，生姜(切)9 g，大枣12 g，法半夏9 g。小柴胡汤药味用量设置均按照高等医药院校教材《伤寒论》中的中药剂量，依据大鼠体重计算灌胃药量，大鼠每日灌胃给药小柴胡汤7.29 g/kg相当于人日用量[13]。将上述7味药放入砂锅，适量水煎，大火煎沸后，再用小火煎20～30 min；第1次煎30 min，第2次煎煮20 min，除去渣合并2次药液，浓缩药液至所需浓度，再将中药汤液放入冰箱保鲜层5 ℃保存备用。

2.2 动物分组及给药

40只健康雄性大鼠按体重随机分为空白对照组、模型组、小柴胡汤实验组和小柴胡汤阴性对照组4组，每组10只。适应性喂养1周后，空白对照组、小柴胡汤阴性对照组大鼠用蒸馏水喂养；模型组、小柴胡汤实验组大鼠用100 mg/L的NaF溶液喂养，建立慢性氟中毒大鼠模型。小柴胡汤实验组、小柴胡汤阴性对照组大鼠分别用小柴胡汤中药汤液灌胃，空白对照组、模型组大鼠则分别灌胃等剂量0.9%氯化钠溶液。持续灌胃90 d(每日1次)后，禁食12 h后将大鼠麻醉，腹主动脉取血，获得血液样本，置于冰上迅速解剖取出肝脏，记录大鼠体重和脏器重量，计算脏器指数(脏器湿重/体重×100%)，分装置于液氮中冷冻保存。

2.3 HE染色法观察肝脏组织病理形态变化

取同一部位的新鲜肝脏样本用4%多聚甲醛溶液固定，并采用常规石蜡技术进行加工。切下4 μm厚的切片，常规HE染色，在光学显微镜下进行病理观察并拍照。

2.4 微板法检测血清ALT和AST水平

AST、ALT常用于反映肝细胞损伤程度，可作为评价肝细胞坏死的重要指标。取血液样本于室温(25 ℃)静置2 h后，1 500 r/min离心10 min，分取血清，按试剂盒说明书检测ALT、AST酶学水平，实验采用3个生物重复，取平均值，最终数据以U/L表示。

2.5 检测MDA、T-SOD水平

MDA和SOD是评估人体抗氧化状态的重要指标，两者活力水平反映抗氧化能力和抵御自由基损伤的能力。采用硫代巴比妥酸(TBA)法检测MDA水平，微板法检测T-SOD水平。取各组大鼠新鲜相同部位肝脏标本，在液氮中制备制成10%的匀浆。匀浆以3 500 r/min低温(4 ℃)离心10 min后取上清液，蛋白定量后，按试剂盒说明书检测肝脏组织中MDA和T-SOD水平，实验采用3个生物重复，取平均值，最终数据表示为nmol/mg蛋白和U/mg蛋白。

2.6 统计学方法

所有数据采用SPSS 19. 0软件进行分析，当数据方差一致时，进行单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有极显著统计学意义。

3 结果

3.1 小柴胡汤对大鼠肝脏指数的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠肝脏指数均明显增大；与模型组比较，小柴胡汤实验组大鼠肝脏指数均显著减小，上述差异均有极显著统计学意义(P<0.01)，见图1。

单因素方差分析，与空白对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01

3.2 小柴胡汤对大鼠肝组织病理学的影响

空白对照组大鼠肝小叶结构清晰且完整，肝索排列较为正常，中央静脉内皮完整，中央静脉周围的肝细胞排列成索状，形态正常，未见明显变性坏死，肝窦结构正常，未见明显淤血扩张及炎症细胞浸润，见图2(A)。模型组大鼠肝小叶正常结构被破坏，肝索断裂，肝细胞点状坏死，见胞核固缩、崩解，胞质溶解，细胞结构不清晰，并伴有少量炎症细胞浸润，以核呈圆形深染的淋巴细胞和核呈杆状的中性粒细胞为主，肝窦内少量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主，见图2(B)。小柴胡汤实验组大鼠肝脏病变范围与严重程度较模型组有明显改善，见图2(C)。小柴胡汤阴性对照组大鼠肝细胞排列较整齐，肝细胞形态完整，肝小叶结构较为完整，未见明显炎症细胞浸润及变性坏死，见图2(D)。

A.空白对照组；B.模型组；C.小柴胡汤实验组；D.小柴胡汤阴性对照组；实线箭头指点状坏死，虚线箭头指炎症细胞浸润

3.3 小柴胡汤对大鼠血清 ALT、AST水平的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST水平明显升高，差异有极显著统计学意义(P<0.01)，表明肝细胞坏死严重；与模型组比较，小柴胡汤实验组大鼠血清ALT、AST水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

3.4 小柴胡汤对大鼠肝组织 MDA、T-SOD水平的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠肝组织MDA、T-SOD水平明显升高；与模型组比较，小柴胡汤实验组大鼠肝组织MDA、T-SOD水平明显降低，上述差异均有极显著统计学意义(P<0.01)，见图4。

A.MDA；B.T-SOD；单因素方差分析，与空白对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01

4 讨论

地方性氟中毒是由于长期暴露于无机氟化物引起的，寻找对地方性氟中毒有效的防治药物意义重大。研究结果表明，氧化应激是在内源性、外源性条件刺激下产生大量活性氧(ROS)，损害肝细胞，氧化应激参与多种肝病的发生和发展，与氟中毒所致肝损伤密切相关[14]。小柴胡汤为临床常用方剂，可在对抗氧化应激所致肝细胞损伤中发挥重要作用[15]。然而，小柴胡汤是否能对氟中毒所致肝损伤起到缓解作用，目前还未见相关报道。本研究旨在探讨小柴胡汤能否缓解氟中毒所致肝损伤，为其预防和治疗地方性氟中毒的临床应用提供重要的理论基础。

ALT和AST主要存在于肝细胞的细胞质和线粒体中，肝损伤后，肝细胞膜的通透性增加以及细胞裂解后内容物的流出，均可导致血清AST、ALT水平升高[16-17]。本研究结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠血清ALT、AST水平显著升高，说明慢性氟中毒能引起肝细胞损伤。景书坛[18]在沙棘多糖预防饮水型氟中毒肝损伤机制的研究中发现，在氟中毒状态下AST、ALT水平显著升高，与本研究结果一致。经小柴胡汤干预，可使大鼠AST、ALT水平降低，表明小柴胡汤对慢性氟中毒所致肝细胞损伤具有缓解作用。李晶晶等[11]在小柴胡汤及其拆方的抗肝细胞损伤效果的研究中发现，小柴胡汤可有效缓解CCl4所致肝细胞损伤，显著降低AST和ALT水平，与本研究结果相符。此外，本研究组织病理学观察结果也显示，慢性氟中毒可引起大鼠肝损伤，而小柴胡汤可在一定程度上减轻肝损伤，这与ALT和AST水平变化结果也一致。

MDA为自由基攻击体内脂质所生成的产物，是脂质过氧化的重要指标，可间接反映氧自由基含量的变化。SOD是人体内最重要的抗氧化酶，能有效清除氧自由基，减少细胞的氧化损伤[19-20]。因此，SOD和MDA活力水平反映机体抗氧化能力和抵御氧自由基损伤的能力。本研究中，与对照组相比，模型组大鼠的SOD水平和MDA含量显著升高，说明在氧化应激状态下大鼠机体的抗氧化平衡可能被打破，大量自由基攻击体内脂质所生成的产物MDA大量堆积，在大量自由基刺激下机体SOD水平升高，但仍不能及时清除体内自由基，造成大鼠肝脏氧化损伤。薛宏慧[21]在3-硝基丙酸诱导的氧化应激下小鼠抗氧化酶含量变化的研究中发现，在氧化应激状态下，MDA含量和SOD水平均呈显著升高，与本研究结果一致。当给予小柴胡汤干预后，大鼠MDA含量、SOD水平降低，表明小柴胡汤可能是通过抑制体内脂质过氧化物的产生，增强清除自由基的能力，从而使得肝脏氧化应激损伤得到缓解。

综上所述，本研究结果证实了慢性氟中毒可引起肝损伤，小柴胡汤对慢性氟中毒所致肝损伤具有一定的缓解作用。小柴胡汤对慢性氟中毒所致肝损伤的保护作用机制可能是通过抑制氧化应激途径，提高机体消除自由基的能力，减少MDA的生成，从而减轻氧化应激所致肝细胞损伤，起到保护肝脏的作用。