乳腺癌组织中HPV 感染与TLR4、NF-κB 蛋白表达的关系及其临床意义

石 喆 任 珊 杨 立 戴文斌

1.广西壮族自治区柳州市人民医院病理科，广西柳州 545001；2.广西壮族自治区柳州市人民医院检验科，广西柳州 545001

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在我国，乳腺癌的发病率和死亡率位居女性恶性肿瘤的第一位和第六位，严重威胁女性的生命健康[1]。目前乳腺癌的5 年生存率可达90%，但乳腺癌患者耐药、复发、转移等预后不良的现象仍然十分常见[2]，探讨乳腺癌发生发展的分子机制，寻找新的诊断标志物和治疗靶点是当前研究的重点。研究表明，人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染可能在乳腺癌的侵袭中起关键作用[3-4]。Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）是最近发现的模式识别受体家族，是先天免疫系统的重要组成部分，在宿主防御的第一道防线中发挥重要作用，但有证据表明TLR4 激活与癌症免疫抑制和生长有关[5]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）已被证实参与调控细胞增殖、分化、凋亡及恶性转化，涉及炎症与肿瘤的发生发展机制[6]。TLRs 通过诱导NF-κB途径阻止免疫应答的激活或增强炎症而与恶性转化相关。本研究采用免疫组织化学染色法检测乳腺浸润性癌、导管上皮非典型增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）和正常乳腺组织标本中HPV16/18E6、TLR4和NF-κB 蛋白的表达，探讨乳腺癌中三者表达的关系及其与临床病理特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择广西壮族自治区柳州市人民医院乳腺外科2018 年1 月至2019 年12 月手术切除浸润性癌乳腺标本50例为癌组、ADH 乳腺标本30例为ADH 组、正常乳腺组织30例为正常组。纳入标准：①柳州地区女性患者；②首次诊断乳腺癌且临床病理资料完整；③两名经验丰富的病理医师对所有组织病理学结果进行审核确认。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤、怀孕及诸如类风湿性关节炎的全身性炎症性疾病；②有放疗、化疗、内分泌治疗及其他生物抗癌治疗等抗肿瘤手段治疗的既往史或现病史。癌组参照2012 年世界卫生组织乳腺肿瘤分类标准进行病理诊断及分期。组织学类型：非特殊型34例，特殊型16例（浸润性小叶癌8例、黏液癌5例、伴髓样分化癌3例）；组织学分级：Ⅰ级8例、Ⅱ级29例、Ⅲ级13例；pTNM分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期31例、Ⅲ～Ⅳ期11例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移25例。从乳腺纤维腺瘤手术获得的30 个瘤旁正常组织标本作为正常组，所有正常组均为健康女性，无雌激素治疗史、口服避孕药、宫颈癌和吸烟史。癌组年龄16～80 岁，平均（48.97±11.43）岁。ADH 组年龄21～71 岁，平均（45.83±11.87）岁。正常组年龄21～72 岁，平均（46.86±11.16）岁。三组年龄比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，符合医学伦理学标准，所有检测方法均获得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 所有标本用10%中性缓冲福尔马林固定，常规制片，切片厚度4 μm，HE 染色，镜下观察。

1.2.2 免疫组织化学染色 即用型小鼠单克隆抗体HPV16/18E6（克隆编号C1P5，货号：GR3225702-14）、TLR4（克隆编号76B357.1，货号：GR3309592-1）及兔多克隆抗体NF-κB p65（货号：GR3309481-1）均购于Abcam 公司（Abcam，Cambridge，MA，USA），稀释浓度均为1∶100。免疫组织化学染色技术采用MaxVison法，试剂盒（货号：Kit-0014）购于福州迈新生物技术开发有限公司。严格按说明书进行操作，用pH 6.0 柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复。用已知宫颈癌HPV16/18E6、TLR4 和NF-κB 阳性切片做阳性对照，PBS 缓冲液取代一抗做阴性对照。

1.3 结果判定

由两位副高级以上职称病理医师采用双盲法进行判读。HPV16/18E6 与NF-κB 蛋白以细胞质和/或细胞核、TLR4 蛋白以细胞膜和/或细胞质呈黄色或棕黄色为阳性染色。TLR4、NF-κB 蛋白染色判读标准：随机取400 倍光镜下5 个视野，每个视野计数100 个细胞。①阳性细胞百分比评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞数占1%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%～100%为4 分；②着色强弱评分：无着色0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。以两者的乘积判定结果，≤3 分为阴性组，＞3 分为阳性组。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，两两比较采用Bonferroni 校正；相关性分析用Spearman相关系数。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组HPV16/18E6、TLR4 与NF-κB 蛋白的表达情况

HPV16/18E6 蛋白棕黄色颗粒定位于细胞质及细胞核，见图1；TLR4 蛋白定位于细胞膜及细胞质，见图2；NF-κB 蛋白阳性定位于细胞质或细胞核，见图3。三组HPV16/18E6、TLR4 与NF-κB 蛋白阳性表达率比较，差异有高度统计学意义（P<0.01）。癌组HPV16/18E6 阳性表达率高于ADH 组和正常组，差异有统计学意义（P <0.017）；癌组TLR4、NF-κB 蛋白阳性表达率高于ADH 组、正常组，ADH 组阳性表达率高于正常组，差异有统计学意义（P <0.017）。见表1。

表1 三组HPV16/18E6、TLR4 和NF-κB 蛋白阳性表达率比较[例（%）]

2.2 ADH 组及癌组中HPV16/18E6 与TLR4、NF-κB蛋白的相关性

ADH 组及癌组中HPV16/18E6 与TLR4、NF-κB蛋白呈正相关（P <0.01）。见表2。

表2 癌组及ADH 组中HPV16/18E6 与TLR4、NF-κB 蛋白的相关性（例）

2.3 ADH 组及癌组中TLR4 与NF-κB 蛋白的相关性

ADH 组及癌组中TLR4 与NF-κB 蛋白呈正相关（P <0.01）。见表3。

表3 ADH 组及癌组中TLR4 与NF-κB 蛋白的相关性（例）

2.4 癌组中HPV16/18E6、TLR4 及NF-κB 蛋白阳性表达与临床病理特征的关系

HPV16/18E6、TLR4 及NF-κB 蛋白阳性表达率与组织学分级、肿瘤直径、淋巴结转移及临床病理分期有关（P<0.05），与年龄、组织学类型无关（P>0.05）。见表4。

表4 HPV16/18E6、TLR4 和NF-κB 蛋白阳性表达与临床病理特征的关系[例（%）]

3 讨论

乳腺癌发病率和死亡率的增加突出了乳腺癌识别与发展相关的新致病因素的重要性。研究显示，病毒感染涉及18%～20%的乳腺癌发生[7-8]，并证实在乳腺癌组织中有HPV 感染的存在，HPV16、18型是最常见的类型[9-10]。研究发现，在同一患者中发生HPV 阳性乳腺癌之前其良性乳腺组织中存在HPV 感染的证据[11]。HPVE6 和E7 癌蛋白通过结合和抑制p53 和p110RB 肿瘤抑制基因，破坏细胞周期调节，在乳腺癌的发生中有潜在作用[12-13]。但有研究显示，HPV 感染与乳腺癌的发生无相关性[14-15]。本研究结果显示，癌组HPV16/18E6 阳性表达率高于ADH 组和正常组（P <0.017），提示HPV 感染涉及乳腺癌的发生过程，HPV16/18E6 在乳腺组织中的表达是检测活动性感染的可靠标志。

持续性HPV 感染可以由于某些特征（包括产生致癌蛋白）诱导活性氧氮分子产生，促进有丝分裂和产生血管生成因子等引发慢性炎症。TLR 作为模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），能够激活多种病原体相关分子模式并与其他PRR 家族相互作用发生一系列信号转导，产生各种炎症介质。炎症性免疫反应的后果有两个方面：一方面，它使生物体能够抵御感染；另一方面，持续炎症环境可以促进肿瘤细胞免疫逃逸。逃避免疫肿瘤监测是癌症的一个公认特征，在与HPV相关的肿瘤中，HPV 可导致这种逃逸的发生[16]。在HPV 感染期间TLRs 过度表达，诱导NF-κB 途径阻止免疫应答的激活或增强炎症，启动HPV16E6/E7 的活性而与恶性转化相关。TLR4 是唯一能够激活衔接蛋白髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖性和独立途径的配体。MyD88 被TLR4激活后，启动参与促炎、抗病毒和抗菌反应的一组特定基因的转录，促进NF-κB 活化，导致炎症细胞因子的产生[17-21]。据报道[22]，TLR4/NFκB 信号通路的异常刺激涉及许多自身免疫性疾病和慢性炎症，NF-κB 调节肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素-1（interleukin，IL-1）、IL-6、细胞周期蛋白D1、c-MYC 等导致细胞增殖，调节血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、TNF、IL-1 和IL-8 有助于血管生成，从而有利于肿瘤发生。NF-κB 在肠癌、胰腺导管癌、肝癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤的转移性密切相关。在乳腺癌细胞系和患者中观察到NF-κB 通路中的抑制蛋白激酶ε的扩增和过表达，进一步强调了NF-κB 与乳腺癌的关系[23-24]。本研究结果显示，癌组HPV16/18E6 阳性表达率高于ADH 组和正常组，癌组TLR4、NF-κB 蛋白阳性表达率高于ADH 组（P <0.017）。癌组及ADH 组中HPV16/18E6 与TLR4、NF-κB 蛋白呈正相关（P <0.01）；TLR4与NF-κB 蛋白呈正相关（P<0.01），提示炎症在HPV16/18E6 阳性乳腺癌诱导中起重要作用。本研究结果显示，HPV16/18E6、TLR4 与NF-κB 蛋白阳性表达率与组织学分级、肿瘤直径、淋巴结转移及临床病理分期有关（P <0.05）。提示HPV16/18E6、TLR4 与NFκB 蛋白在乳腺癌的发展、浸润转移中起着重要的作用。

综上所述，高危型HPV 感染与乳腺癌的发生、发展有关，HPV 感染导致TLR4/NF-κB 信号通路的异常可能与乳腺癌患者预后不良之间有一定的关联，TLR4、NF-κB 可作为新的预后生物标志物应用于乳腺癌预后的评价。将HPV 疫苗、调节TLR4/NF-κB 信号通路以及TLR4 拮抗剂作为乳腺癌的预防和治疗策略，可能在防御癌症或改善预后方面具有广泛应用前景。