褪黑素对尼莫司汀抑制胶质瘤U118细胞增殖的增敏效应研究

龙艳春，朱佳斌，孙欢，郑旭，尚发军

三峡大学附属仁和医院神经外科，湖北 宜昌 443000

胶质瘤约占成人中枢神经系肿瘤的80%，具有高发病率、高复发率、高死亡率的特点[1]。目前临床上治疗胶质瘤主要采取手术切除后辅以放疗和化疗的治疗方法，但效果差，中位生存期仅为14.6 个月[2]。因此，迫切需要寻找新的治疗胶质瘤的方法。尼莫司汀是一种能够通过血脑屏障的亚硝脲类药物，具有烷化作用，广泛用于胶质瘤的治疗。然而，约半数以上的胶质瘤对尼莫司汀耐药[3]。褪黑素是由脑松果体分泌的激素，可增强多种化疗药物的疗效[4-7]。因此，本研究拟在胶质瘤U118 细胞中观察褪黑素对尼莫司汀化疗增敏效应，尝试通过体外实验阐述其机制，为这两种药物相结合治疗胶质瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 人胶质瘤U251细胞株购自美国模式培养物集存库(American Typeculture Collection，ATCC)；DMEM 培养基(美国Hyclone 公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries 公司)；青-链霉素双抗(上海碧云天生物技术有限公司)；CCK-8 (美国Bimake 公司)；反转录试剂盒(日本TaKaRa 公司)；Talent 荧光定量检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；COX-2 抗体、GAPDH 抗体、p-IB 抗体和IB 抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.2 细胞培养 DMEM 培养基+质量分数为10%胎牛血清+质量分数为1%青-链霉素双抗，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。

1.3 CCK-8 实验 取对数生长期U118 细胞，按5000/孔接种于96 孔培养板内。37 ℃、5%CO2培养24 h 后，实验组中分别加入含不同浓度褪黑素和(或)尼莫司汀培养液，每组设3个复孔。培养48 h后，除去上清培养基，加入新鲜的含10%CCK-8的培养基。继续培养1 h 后，于酶标仪450 nm 波长处检测各孔的吸光度A值。细胞存活率(%)=(实验组平均A 值/对照组平均A 值)×100%。

1.4 协同实验 实验分为四组，即对照组、褪黑素组(0.75 mmol/L)、尼莫司汀组(100 μmol/L)、联合治疗组(0.75 mmol/L褪黑素联合100 μmol/L 尼莫司汀)，通过CCK-8 实验检测各组吸光度。两药相互作用指数(coefficient of drug interaction，CDI) 的计算公式为:CDI=AB/(A×B)。AB 为联合治疗组与对照组吸光度值(450 nm)的比值，A 或B 是各药物单独使用组与对照组吸光度值(450 nm)的比值。当CDI＜1 时，两药有协同作用。

1.5 平板克隆实验 取对数生长期U118 细胞，以每孔1000 个U118细胞接种至6孔板中。37℃、5%CO2培养24 h 后，实验组中分别加入含不同浓度褪黑素和(或)尼莫司汀培养液。48 h后更换培养基继续培养2 周后，吸出培养基，并用PBS 洗3 次，晾干后用结晶紫染色。

1.6 COX-2 mRNA水平检测 各组加药处理48 h后，按反转录试剂盒说明书的步骤操作，以多聚A尾法对目的基因进行反转录，反转录产物加入COX-2 与GAPDH的基因引物，使用Talent荧光定量检测试剂盒进行Real-Time PCR 反应。采用2-ΔΔCT法进行相对定量。GAPDH 的引物序列为：5'-CAT GAG AAG TAT GAC AAC AGC CT-3' (forward)；5'-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG T-3'(reverse)；COX2 的引物序列为：5'-CAG CCA TAC AGC AAA TCC TTG-3'(forward)；5'-CAA ATG TGA TCT GGA TGT CAA C-3'(reverse).

1.7 Western blot 检测蛋白表达 各组加药处理48 h 后，按照常规办法提取总蛋白，经蛋白定量后行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，将蛋白转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜5%脱脂奶粉封闭2 h，加入COX-2(1∶500)、β-actin(1∶2000)、p-IB(1∶500)、IB(1∶1000)，轻摇过夜，TBST洗3次，ECL化学发光液显色检测。

1.8 统计学方法 所有实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间两两比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析或析因设计方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 褪黑素联合尼莫司汀对U118细胞存活率的影响 CCK-8实验中，与对照组比较，褪黑素、尼莫司汀单独或者协同给药处理对U118 细胞均有明显的抑制作用，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。协同实验中，褪黑素(0.75 mmol/L)联合尼莫司汀(100 μmol/L)时，U118 细胞的CDI为0.43。因此，选取0.75 mmol/L褪黑素和100 μmol/L 尼莫司汀作为后续实验的给药浓度。平板克隆实验中，与尼莫司汀组比较，联合治疗组中U118细胞的克隆形成能力明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

图1 褪黑素和尼莫司汀单独及联合对U118细胞存活率的影响

图2 褪黑素联合尼莫司汀对U118细胞克隆形成的影响(×1，结晶紫染色)

2.2 褪黑素联合尼莫司汀对U118细胞中COX-2表达的影响 与尼莫司汀组比较，联合治疗组U118细胞中COX-2 mRNA 和蛋白水平均明显降低, 差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3和图4。

图3 褪黑素联合尼莫司汀对U118细胞中COX-2蛋白表达的影响

图4 褪黑素联合尼莫司汀对U118细胞中COX-2 mRNA表达的影响

2.3 褪黑素联合尼莫司汀对NF-κB信号通路的影响 与尼莫司汀组比较，联合治疗组中p-IB/IB的水平均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图5。

图5 褪黑素联合尼莫司汀对NF-κB信号通路的影响

3 讨论

尼莫司汀是胶质瘤一线标准化疗方案的组成部分。但是，高剂量的尼莫司汀会产生诸如骨髓抑制、间质性肺炎、肺纤维化、消化道反应等不良反应，并且某些胶质瘤患者对尼莫司汀的治疗表现出抗性[3]。目前已经有多项研究表明，尼莫司汀联合其他药物可以增强其治疗胶质瘤的效果并减少其副作用[3，8-9]。褪黑素能够抑制胶质瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡[10]。研究还表明，褪黑素可以通过调节miR-6858 的表达抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移[11]。因此，本研究拟通过体外实验研究褪黑素对尼莫司汀化疗增敏效应，并探明其机制，以期发现新的治疗胶质瘤的方案。

本研究显示，褪黑素、尼莫司汀单独或者协同给药对胶质瘤U118 细胞均具有生长抑制作用。协同实验中，褪黑素(0.75 mmol/L)联合尼莫司汀(100 μmol/L)时，U118 细胞的CDI 为0.43。由此可见，一定浓度的褪黑素对尼莫司汀具有明显的化疗增敏效应。平板克隆实验从细胞集落形成能力角度进一步证实了褪黑素能增强尼莫司汀对胶质瘤的抑制作用。

此外，COX-2 表达与胶质瘤对化疗抵抗和预后相关[3，12]。COX-2 是前列腺素合成的关键酶，在正常组织细胞中一般不表达或者低表达，在胶质瘤细胞中高表达[12]。COX-2主要定位于核膜，其催化产生的前列腺素类物质产物可进入核内，调节靶细胞基因的转录。COX-2通过促进血管生成及转移、抑制机体免疫等促进肿瘤恶性进展[13]。Cox-2 基因为诱导性表达，其启动子含有NF-κB的结合位点，NF-κB与转录共激活因子CBP/p300能结合于该位点并上调COX-2的表达[14]。研究结果发现，褪黑素可增强尼莫司汀抑制U118细胞中COX-2 mRNA和蛋白的表达。

NF-κB信号通路是细胞内重要的信号转导系统，属于受调蛋白水解酶依赖的受体信号转导通路。在未受刺激的细胞中，NF-κB与IκB蛋白结合在一起滞留在细胞质中。在未受刺激的细胞中，NF-κB转录因子与抑制性IκB 蛋白结合在一起，因而被滞留在细胞质中[15]。上游信号的刺激导致IκB 蛋白在IKK的作用下被磷酸化修饰，继而被泛素连接酶复合体识别，促使IκB 蛋白以蛋白酶体依赖的方式被降解，NF-κB 从而被释放出来，进入细胞核并启动靶基因的表达[15]。NF-κB 信号通路在胶质瘤恶性进展中起着重要的作用[16-18]。在本研究中，褪黑素可增强尼莫司汀抑制U118细胞中p-IκBα/IκBα的表达。

综上所述，褪黑素可增强尼莫司汀对胶质瘤U118细胞增殖的抑制作用，初步证实两种药物相结合治疗胶质瘤的应用潜力。两种药物相结合通过抑制NF-κB信号通路，抑制COX-2 mRNA 和蛋白的表达，从而抑制胶质瘤增殖，为胶质瘤的治疗提供新的潜在方案。本研究缺少动物实验，同时并未阐明NF-κB信号通路在这一过程中是否起决定性作用。本课题组下一步将对褪黑素增强尼莫司汀抑制胶质瘤增殖的分子机制展开进一步研究，并开展相关动物实验，以期为临床应用褪黑素联合尼莫司汀治疗胶质瘤提供理论依据。