UPLC-MS法测定动物源性食品中12种大环内酯类抗生素残留量

◎ 贾琳斐，管 理，贾润芳，尹 静，张 鑫

(咸阳市食品药品检验检测中心，陕西 咸阳 712000)

大环内酯类药物是一类快速抑制蛋白质合成的抑菌药，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有良好的抗菌作用[1-2]。大环内酯类抗生素在临床上常用于上呼吸道感染、泌尿道感染的治疗[3-4]，少量使用能促进畜禽类的生长，故广泛应用于兽药领域[5]。

大环内酯类抗生素检测方法主要有紫外分光光度法[6]、毛细管电泳-电化学法[7]、气相色谱-串联质谱法[8]及液相色谱-串联质谱法[9]。其中，紫外分光光度法、毛细管电泳-电化学法、气相色谱-串联质谱法因灵敏度、准确度均较低及被检样品种类受限等原因，研究鲜有报道。目前，液相色谱-串联质谱法为大环内酯类抗生素的主要检测手段，前处理技术多采用QuEChERS法[10]或固相萃取法[11]，但这些方法或检出限较高、或大环内酯类检测种类较少。本研究选取具有代表性的12种大环内酯类抗生素，通过对提取条件、基质效应的影响进行分析，为动物源性食品中多种大环内酯类兽药残留的快捷、准确监测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈，色谱纯，默克公司；HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL）、C18色谱柱（500 mg /3 mL），均为艾杰尔公司；12种大环内酯类标准品均由CATO公司提供；动物源性样品均来自咸阳市区农贸市场及大型超市，取可食部分绞碎、混匀，-20 ℃冷冻保存。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱联用仪Qsight 210，美国PerKin Elmer公司；RV-10旋转蒸发仪，德国IKA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

分别称取适量12种大环内酯类标准品于容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得到浓度为100 μg·mL-1的大环内酯类标准储备液，冷冻保存。分别移取适量的各单标储备溶液，空白基质稀释，配制成大环内酯类标准工作液。

1.3.2 样品处理

提取：称取均质后的试样5 g，于50 mL塑料离心管中，加入20 mL 1%酸化乙腈，涡旋1 min，超声5 min，5 000 r·min-1离心6 min，取上清液转移至另一离心管中，残渣再加15 mL乙腈，重复提取一次，合并上清液，备用。净化：预先用5 mL乙腈活化HLB固相萃取柱，上清液过柱，收集洗脱液，加入异丙醇4 mL，40 ℃蒸发至干；加入2 mL乙腈乙酸铵（1∶4）溶解残余物，加乙腈饱和正己烷2 mL，转至离心管中，旋涡 10 s，5 000 r·min-1离心 5 min，取下层清液过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱温：40 ℃；进样体积：5 μL；流速：0.3 mL·min-1；流动相：A为5 mmol·L-1乙酸铵，B为0.1%甲酸乙腈；梯度洗脱：0～2 min，A∶B为95∶5；2～5 min，A∶B为 50∶ 50；5～ 6 min，A∶B为5∶ 95；6～8 min，A∶B为5∶95；8.0～8.3 min，A∶B为95∶5；8.3～11.0 min保持95∶5。

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子源正离子模式，多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM），干燥器流速：100 μL·min-1；脱溶剂气温度：300 ℃；雾化器流速：200 μL·min-1；离子源喷雾电压：5 500 V；离子源温度：300 ℃。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

为提高提取效率，本研究比较了乙腈、1%酸化乙腈、乙腈-乙酸乙酯（体积比1∶1）对动物源食品中大环内酯类抗生素药物残留的提取效果，图1结果表明，采用乙腈、乙腈-乙酸乙酯（体积比1∶1）提取液提取目标物质后回收率较低，回收率在20%～60%；1%酸化乙腈对12种大环内酯类抗生素的提取效率最高，回收率均在60%以上。

图1 3种溶剂对12种化合物回收率的影响图

2.2 基质效应的评价与消除

对于动物源性等较复杂样品，基质效应影响样品测定的准确性。因此，在样品测定时应建立基质效应（Matrix Effect，ME）的评价，一般较为简单的评价方法为相对响应值法，A为空白样品基质中添加的相同含量标准物质的响应值，B为纯溶剂中标准物质的响应值，ME=A/B×100%，当ME＜1.0时，则存在基质抑制效应；当ME＞1.0时，则存在基质增强效应[12]。表1实验结果表明，12种化合物在3种不同基质中的基质效应在0.16～1.31。其中，3种基质对交沙霉素，鸡肉对克拉霉素、林可霉素均无明显的基质效应（ME=1±0.1）；猪肉对克拉霉素、林可霉素均有基质增强效应，3种基质对其余化合物均有基质抑制作用。

表1 12种大环内酯类在不同基质中的基质效应评价表

消除基质效应的方法包括改进前处理净化方法、同位素内标法、基质配制标准曲线法，综合考虑，本研究采用基质配制标准曲线法，能够很好地消除基质效应，满足残留物的检测。

2.3 检出限与定量下限

采用空白样品配制与待测样品相同基质的系列标准溶液，浓度分别为 2 ng·mL-1、4 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、50 ng·mL-1、80 ng·mL-1和100 ng·mL-1，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制工作曲线，外标法定量。结果显示，各化合物均在2～100 ng·mL-1浓度线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.99。以3倍的信噪比确定检出限，10倍的信噪比确定定量下限，得到12种大环内酯类化合物的检出限均为 0.1 μg·kg-1，定量下限均为 0.3 μg·kg-1。

2.4 回收率与精密度

准确称取阴性试样猪肉、鸡肉、牛肉并按照1.3.2的样品前处理方法进行回收率及精密度的考察。向其中加入 0.3 μg·kg-1、0.6 μg·kg-1、3.0 μg·kg-13 种不同浓度进行3个梯度加标水平的回收率测定，每个添加水平测6个平行样品。基质空白标准曲线进行定量测定，计算平均回收率和精密度，结果见表2。12种抗生素的平均回收率为69.2%～105.3%，相对标准偏差均在9.5%以内。该方法精密度、回收率均满足痕量实验分析要求。

表2 12种大环内酯类抗生素的加标平均回收率及精密度表

2.5 实际样品的分析

应用本方法对咸阳市区大型超市、农贸市场抽检的猪肉、鸡肉、牛肉各20批进行检测，结果显示，1批次猪肉检出红霉素，残留量为8.2 μg·kg-1，其余样品均未检出上述12种大环内酯类抗生素残留物。

3 结论

本研究通过对提取条件的优化、基质效应的影响分析，建立了超高效液相-串联质谱联用仪检测动物源性食品中的12种大环内酯类抗生素残留量的方法；得到12种大环内酯类化合物的检出限均为0.1 μg·kg-1及定量下限均为0.3 μg·kg-1。12种抗生素的平均回收率为69.2%～105.3%，精密度均在9.5%以内。本方法易操作，准确度高，重复性好，满足批量检测动物源性食品中的大环内酯类抗生素的需求。