ELISA 法测定麸质过敏原及其不确定度的评估

◎ 杨 琳，王 震

（诺安实力可商品检验（上海）有限公司，上海 201112）

食物过敏是由人体免疫系统对食物中特定蛋白质的反应引起的敏感性。目前有＞6%的幼儿和3%～4%的成年人存在食物过敏现象。在过敏的个体中，特定的食物蛋白质会被免疫系统误认为是有害的，当过敏个体第一次接触到这种蛋白质时，身体的免疫系统会产生称为免疫球蛋白E（IgE）的抗体，当过敏个体再次暴露于相同的食物蛋白质时，IgE抗体和化学物质（如组胺）就会释放出来。组胺是一种强大的化学物质，可引起呼吸系统、胃肠道、皮肤或心血管系统的反应。在极端情况下，食物过敏甚至可能致命。尽管任何食物都能激发过敏个体的免疫反应，但只有少数食物是导致食物过敏的原因。

近几年的普查结果显示我国的乳糜泻发生率为1‰～3‰，而欧洲人和澳洲人乳糜泻的发生率则更高，为3‰～4‰。导致乳糜泻的主要原因是长期食用含麸质的谷物，包括小麦、黑麦、大麦、燕麦、斯佩尔特小麦、卡姆小麦或其杂交品系及其制品。因此食品制造商通过在产品上清楚地贴上成分清单来保护那些对食品过敏的人。这个在欧洲食品标示中为强制规定，澳洲相关法规更是规定麸质含量大于＞20 mg·kg-1的食品，必须强制在食品上申明[1-2]。所以过敏原的检测可确保食品制造商在制造之前及期间，具有潜在危险的过敏成分不会进入食品中。

现阶段过敏原的检测有酶联免疫吸附分析（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、侧向流动（Lateral Flow Testing，LFT）、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和液相色谱-质谱/质谱联用（LC-MS/MS）几种方法。其中LC-MS/MS设备相对昂贵；与ELISA相比，PCR的主要缺点是不针对过敏蛋白，针对DNA，而DNA的检测并不意味着过敏蛋白的存在，且PCR只能定性测试，无法进行定量测试；侧向流动仅为定性测试。因此首选以及最常用的方法是用ELISA检测。

本文使用酶联免疫吸附分析（ELISA）的方法测试麸质过敏原。实验选用大豆分离蛋白、薯条、淋洗水为样品，测定样品空白，同时使用标准品在线性最低点、中间点浓度对以上3个样品进行3平行加标并重复2天测试，以验证测试的定量限、重复性和重现性，以确认该方法的可行性。同时用线性最低点浓度加标的样品含量对于整体的测试进行不确定度评估。

1 材料与方法

1.1 试剂与标准品

麸质有证标准物质，购自Sigma-Aldrich，CAS号为8002-80-0，纯度85%；麸质过敏原试剂盒，购自Biofront，型号为MonoTrace Glu-EK-96；纯净水，购自哇哈哈纯净水；无水乙醇，色谱纯，购自上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

本实验用到的主要实验设备见表1。

1.3 测试流程

称取0.25 g经过充分研磨的食品样品或0.25 mL液体样品到聚丙烯离心管中。向试样中加入10 mL预热的萃取缓冲液（60%乙醇、焦亚硫酸钠和谷胱甘肽），并短暂涡旋使其悬浮混匀。将装有试样的试管在60 ℃下培养试管1 h，每隔15 min剧烈振摇一次，以提取样品中的蛋白质。将试样在室温下以2 000g离心10 min，并用样品稀释剂将样品提取液稀释10倍。取200 μL稀释过的样品提取液和标准品添加到相应的孔中，使样品中的麸质抗原与包被在试剂盒微孔板中的多克隆抗体结合，并在孔中形成抗原-抗体复合物。在22 ℃孵育10 min。小心倒出测试条孔中的液体，在吸水纸上拍打至干。用洗涤缓冲液清洗3次，并每次拍打吸干，以清洗去除未结合的麸质抗原。向每个孔中添加100 μL抗麸质辣根过氧化物酶（HRP）。将其置于避光环境中，22 ℃孵育10 min，此时酶与已形成的抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体夹心。小心将测试条孔中液体倒出，清洗并拍打吸干，去除多余的结合抗体。每孔添加100 μL高灵敏度3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物后，22 ℃避光孵育10 min，向每个孔中添加100 μL反应终止液，轻轻振摇进行混合，以防止产生气泡干扰吸光度读数。由于复合物上结合了酶，导致酶底物的加入后有颜色的产生，且颜色的强度与食物中麸质的浓度成正比，所以使用装有吸光度在450 nm的酶标仪读取微孔的吸光度，并绘制标准曲线[3]。

1.4 实验测量方法与数学模型

实验测量方法为称样→提取→孵育→离心→稀释→孵育→洗板→加麸质抗体共轭物→孵育→洗板→加底物→孵育→加终止液→读数。被测量的数学模型：

式中：X为试样中麸质过敏原的含量，mg·kg-1；C为测定用试样液中麸质过敏原的浓度，μg·mL-1；M为试样质量，g；V为试样的最后定容体积，mL。

2 结果与分析

2.1 线性范围与数据结果

取大豆分离蛋白、薯条、淋洗水空白基质样品，取3份不加入标准品直接测试，通过3 d对空白基质的测定，得到的结果均为0 mg·kg-1，基质样品中的数值均＜检出限的1/3，表明基质对加标没有干扰，这3种基质与试剂盒之间没有交叉反应。另取样品分别于每份样品中加入标准曲线范围低、中浓度的标准溶液各3份后，重复2 d，按照1.3的试验步骤测试，标准物质曲线见图1，基质加标数据见表2。

以标样的浓度（μg·mL-1）为横坐标，从仪器读取450 nm的吸光度为纵坐标，绘制标准工作三次曲线，标准工作三次曲线的线性相关系数在2～100 μg·mL-1为R2=1，见图1，满足＞0.995的要求，说明线性在该定量范围内符合标准要求[4]。各个基质最低加标水平2 mg·kg-1均能够同时满足精密度和准确度的要求，所以加标最低点2 mg·kg-1即为此次验证的定量限，同时该定量限也完全能满足20 mg·kg-1的欧盟相关法规要求。

图1 标准物质曲线图

通过2个浓度点的基质加标并测试2 d，计算得出2 d测试的结果，并计算其回收率，同时对方法的准确度、重复性与重现性进行验证，结果见表2。发现不同浓度水平的回收率均能满足70%～120%的要求，证明其准确度符合标准要求；基质2个加标水平的回收率的相对标准偏差均能满足＜20%的要求，证明其重复性及重现性符合标准要求[4]。

表2 基质加标数据表

2.2 不确定度的来源的确定和分析

2.2.1 A类不确定度的来源

取大豆分离蛋白基质的最低点加标的6个平行测定结果计算麸质过敏原含量的相对标准不确定度urel(X)。6 次的结果分别为 1.8 mg·kg-1、1.9 mg·kg-1、1.8 mg·kg-1、2.3 mg·kg-1、2.1 mg·kg-1和 2.3 mg·kg-1，平均值为 2.03 mg·kg-1[5-6]。

麸质过敏原含量测定重复性标准不确定度为：

麸质过敏原含量测定重复性相对标准不确定度为：

2.2.2 B类不确定度来源

（1）样品称量m引起的不确定度urel(M)。用万分之一电子天平进行样品的称量，其分度值为0.1 mg，取均匀分布，包含因子则可读性的不确定度为天平校正产生的不确定度，按检定证书给出的称量误差为±0.3 mg，假设为均匀分布，

由此2项合成得出称量的标准不确定度为：

得出称量引起的相对标准不确定度为urel(M)=u(M)/0.25 g=7.28×10-4。

（2）10 mL移液器移取提取液引起的不确定度urel(V)。样品提取时加入10 mL提取液。移液器的不确定度来源于移液器产生的不确定度u(V1)和温度效应产生的不确定度u(T)。

移液器产生的不确定度：10 mL移液器，其不确定度由SIMT校定给出扩展不确定度U=12 μL，k=2；标准不确定度为u(V1)=U/k=6 μL。

温度效应产生的不确定度：移液器一般在20 ℃下被校准，实验室的环境温度一般为（20±5）℃，水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1，按矩形分布10 mL移液器由温度效应引入的标准不确定度为u(T)=10 000×5×2.1×10-4/则相对标准不确定度为：

（3）配制标准工作液引起的不确定度urel(std)。制备工作曲线标准溶液时，使用了1 000 μL移液枪。1 000 μL移液枪的扩展不确定度U=3.5 μL，k=2；按矩形分布，温度效应引入的标准不确定度为1 000×5×2.1×

则相对标准不确定度为：

（4）测试用样液体积引起的不确定度urel(V2)。吸取100 μL样品提取液上机测试。使用100 μL移液枪，其扩展不确定度U=0.6 μL，k=2；按矩形分布，温度效应引入的标准不确定度为100×5×2.1×10-4/

则相对标准不确定度为：

（5）酶标仪引入的不确定度urel(A)。由校准证书给出仪器扩展不确定度为吸光度U=0.06（k=2），则相对不确定度为urel(A)=0.06/2=0.03。

（6）孵育时间引入的不确定度urel(T)。实验中共孵育3次，孵育时间均为10 min。已校准过的计时器扩展不确定度为U=1 s（k=2），则由温育时间引入的相对标准不确定度为：

（7）孵育温度引入的不确定度urel(W)。实验中共孵育3次，孵育温度均为22 ℃。已校准过的孵育箱扩展不确定度为U=0.4 ℃（k=2），则由温育温度引入的相对标准不确定度为：

2.2.3 计算合成相对不确定度urel(X)

合成相对不确定度urel(X)为：

2.2.4 计算扩展不确定度

在95%的置信概率下时，扩展因子k=2，则大豆分离蛋白中的麸质过敏原含量的扩展不确定度为U=2×0.058 7=11.7%。则麸质过敏原含量的测定结果可以表述为X=（2±0.234）mg·kg-1（k=2）。

2.3 不确定度评估

选取大豆分离蛋白基质的最低点加标数据作为A类不确定度的数据来源，统计测试的各个环节中所使用到的定量设备以及温度和时间等关键因素作为B类不确定度的数据来源，最后合成A类与B类不确定度，从而得出一个合成扩展不确定度作为方法的不确定度U=2×0.058 7=11.7%（k=2）。

3 结论

从实验结果可以看出采用ELISA的方法可以准确测定大豆分离蛋白、薯条、淋洗水中麸质的含量，其准确性和精密度均能符合标准要求、不确定度也能比较准确地体现该方法结果的可信赖程度、检出限也能符合欧盟的法规要求。表明本文通过ELISA的测试方法解决了LC-MS/MS测试成本高、PCR只能测基因片段而不是测试致敏蛋白导致的假阳性问题以及PCR和侧向流动技术仅为定性法的问题，因此采用该方法测试麸质过敏原是一个成本较低、定量准确的较好的选择，不仅有利于企业对自己上市的产品进行筛查，还利于监管单位对市售产品进行监管。