液相色谱-质谱/质谱法检测虾中四环素

◎ 包东东，唐 波，田 锋，谭慧林

（阿克苏地区食品安全检测中心，新疆 阿克苏 843000）

四环素类药物（Tetracyclines，TCs）是一种天然或半人工合成药物，能抑制和杀死多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、衣原体、支原体等致病微生物。四环素类药物种类很多，有20余种，见的较多的有四环素、强力霉素、金霉素（Chlortetracycline，CTC）和土霉素等。在畜牧业养殖中，由于四环素类药物价格偏低、抗菌效果显著，被广泛用于动物疾病防治中。因此，四环素类药物的消耗量占动物疫情防控的总药量偏高，其中欧盟约为46%，美国约为15.8%。四环素药物的过量使用，导致动物源性食品和环境中四环素类药物残留较高。消费者长期食用四环素类药物残留超标的食品，可出现牙齿变黄、过敏反应、肝脏损伤、肠道紊乱等不良反应，部分动物源性食品中所含的四环素类等抗生素被食用后会造成机体发生过敏反应，部分患者可能出现荨麻疹、急性血管性水肿、休克甚至死亡；部分药物在被人体食用后还会诱发基因突变，引发“三致作用”，有的还可导致体内细菌耐药性增强。四环素较稳定，可经尿、粪便排向外界环境，会引起环境污染，环境中药物残留可导致微生物耐药性增强，出现新的耐药菌株，给公共卫生造成危害。因此，加强动物源性食品四环素类药物及其代谢物检测，对保障公共卫生安全具有重要意义[1]。

检测四环素药物残留的方法有仪器分析法、免疫学法、微生物法、生物传感器等，其中被广泛应用于检验分析的主要是仪器分析法和免疫学法。免疫学法由于操作简单、检测速度快、成本低、对检验人员专业要求不严格等优点多用于现场快速检测及样品初筛[2]。与免疫学法相比，仪器分析法具有结果准确可靠、重现性好、稳定性高等优点，并可实现对多类药物的快速定量检测，被用于药物残留检测和确证。高效液相色谱法及液相色谱串联质谱法是最常用的仪器分析法。

为确保本实验室检测动物源性食品中四环素残留的准确性，本实验室参加了中国检验检疫科学研究院组织的虾中四环素检测能力验证，样品编号为7-F701，17-T228。本实验室通过利用能力验证这种外部质量保证工具，识别与同行机构之间的差异，补充内部质量控制技术，为自身的持续改进和质量管理提供信息[3]。此次能力验证可判断实验室和检查机构等是否具有从事校准/检测活动的能力，以及监控能力的持续状况，不断提升检验检测能力，打造重点综合性实验室。本实验室采用了常用的检测方法《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》（GB/T 21317—2007）进行检测。在此次能力验证中，利用现有的实验室设备对标准方法进行了优化，最终取得了满意结果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾粉样品：中国检验检疫科学研究院能力验证样品，样品1编号为17-F701，样品2编号为17-T228。

四环素标准品，1 000 mg·L-1，农业部保护科研监测所；柠檬酸，分析纯，上海埃彼化学试剂有限公司；磷酸氢二钠，分析纯，天津恒信试剂厂；乙酸乙酯，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲酸，色谱纯，纯度≥88%，上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯，纯度99.9%，德国Merk公司；HLB固相萃取柱，60 mg/3 mL，上海安谱实验科技股份有限公司；缓冲溶液：将1 000 mL 0.1 mol·L-1磷酸二钠溶液与625 mL 0.2 mol·L-1磷酸氢二钠溶液混合；Na2EDTA-McLLvaine缓冲溶液：秤取60.5 g乙二胺四乙酸二钠放入1 625 mL McLLvaine缓冲溶液，使其溶解，摇匀。三氟乙酸溶液10 mmol·L-1。

1.2 仪器与设备

电子分析天平，感量0.01 g（梅特勒托利多）；液相色谱-质谱/质谱仪配有电喷雾（ESI）源（赛默飞世尔仪器公司）；超声清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；低温离心机，最高转速5 000 r·min-1，控温范围为-40 ℃至室温（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；J2固相萃取仪（美国J2 Scientific）；氮吹仪（北京同泰联科技发展）；涡旋仪（法国梅里埃）；pH计，测量精度±0.02（上海仪电物理光学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

用四环素标准品（1 000 mg·L-1），按照 10倍稀释梯度，分别配制成 0.02 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1、0.30 mg·L-1和 0.50 mg·L-1一系列浓度标准溶液，密封待用。

1.3.2 检测方法

试样中的四环素残留用0.1 mol·L-1Na2EDTAMcLLvaine缓冲溶液（pH=4.0）提取，经过滤、高速离心后，上清液经HLB固相萃取柱净化，进液相色谱-质谱联仪测定，外标峰面积法定量。

称取虾粉样品3.00 g，加水复原至6 g，倒入50 mL聚丙烯离心管中，分别用约20 mL、20 mL、10 mL 0.1 mL·L-1Na2EDTA-McLLvaine缓冲溶液冰水浴超声提取3次，每次涡旋混合1 min，超声提取10 min，3 000 r·min-1离心5 min（温度低于15 ℃），合并上清液，定容至50 mL，混匀，5 000 r·min-1离心10 min（温度低于15 ℃），过滤，吸取10 mL滤液，过活化后的HLB固相萃取柱，样液流完后，用5 mL水和5 mL甲醇+水（1+19，V/V）淋洗，用固相萃取仪吹干，再用10 mL甲醇+乙酸乙酯（1+9，V/V）洗脱，将浓缩液用氮吹仪吹干，用1 mL甲醇+三氟乙酸（1+19，V/V）溶液溶解残渣，过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.4 仪器条件及测定方法

1.4.1 液相及质谱条件

液相条件：色谱柱WATERS UPLC C8-3柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相：甲醇 +10 mmol·L-1三氟乙酸溶液（1+19，V/V）；流速：200 μL·min-1；柱温度：30 ℃；进样量：10 μL。

1.4.2 质谱条件

质谱仪离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）；质谱扫描方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；分辨率：单位分辨率；碰撞气：20 L·h-（1氩气）；去溶剂气：500 L·h-1（氮气）；离子源温度：350 ℃。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

样品净化使用了HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱，实验表明，HLB固相萃取柱吸附容量是键合硅胶固定相的3～10倍[4]，可达到较好的净化效果，因此选用HLB固相萃取柱为样品净化柱。考虑到液质方法中流动相为乙腈+水（1∶9，含0.2%甲酸）溶解，所以将标准溶液及前处理浓缩后残渣均用10%乙腈与90%水进行溶解，其中水相含0.2%甲酸溶液，溶解后必须充分混匀。

2.2 液质联用仪质谱条件优化

2.2.1 液相色谱条件优化

实验中流动相使用了不同流速对液相色谱进行优化，分别使用 0.1 mL·min-1、0.2 mL·min-1、0.3 mL·min-1流速作为流动相；使用不同柱温（30 ℃、35 ℃、40 ℃）、不同柱长的WATERS UPLC C8-3柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）和WATERS UPLC C8-3柱（150 mm×10 mm，5 μm）分别进行实验分析。实验表明，0.2 mL·min-1流速符合实验条件，同时可达到减少试剂使用量、废液排出量等实验目的；35 ℃柱温条件下四环素药物分离效果良好，峰形良好；色谱柱选用WATERS UPLC C8-3柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），出峰时间提前0.5 min，且售价更加便宜。最终选择0.2 mL·min-1的流速、柱温35 ℃、WATERS UPLC C8-3柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）为最佳色谱分离条件。

2.2.2 质谱条件的优化

有研究表明，四环素药物易溶于有机溶剂，如乙腈、甲醇、丙酮、三氯甲烷等。实验中，一般选择甲醇、乙腈作为色谱流动相，在液相色谱质谱中乙腈的分离效果优于甲醇。在流动相中加入少量的酸可以提高电离效应、改善峰形。GB/T 21317—2007以三氟乙酸作为酸化试剂，但三氟乙酸对质谱信号有抑制作用，在使用过程中会残留在离子通道及离子源中，污染仪器管路，使柱压增高，降低仪器寿命，而在液相质谱中常使用甲酸作为流动相，使目标物分离效果好，污染少，有利于质谱仪的长期使用，因此选择甲酸作为酸化试剂[5-6]。

实验中配制了0.1%、0.2%、0.3%及0.4%浓度的甲酸水溶液，分别和乙腈组成流动相，将四环素目标物注入质谱仪，查看离子化效率。结果表明，甲酸浓度增高，液相质谱仪离子源灵敏度也随之增高，考虑到甲酸溶液的浓度过高，对仪器泵、管路及离子源带来损坏，而0.2%甲酸溶液已能满足该实验分离需要，峰形较好，无拖尾现象，因此选择0.2%甲酸水溶液作为最终流动相。

将10 mg·L-1四环素标准溶液注入质谱仪中，在MS Scan模式下，得到母离子相应碎片，在Daughter Scan模式下，得到子离子相应的碎片；在MSMS模式下，优化锥孔电压和碰撞能量，优化后的母离子、子离子、碰撞电压及锥孔电压参数为母离子445.1m/z，子离子428.1m/z（定量离子）、154.1m/z，碰撞电压28 V，锥孔电压22 V。

2.3 检测结果分析

2.3.1 曲线线性关系及仪器检出限

以峰面积对应的浓度进行线性回归，线性方程为y=6 226.16x-11.917 8，相关系数R2=0.998 914。根据四环素化合物的定性离子的重构色谱峰的信噪比≥3，定量离子的重构色谱峰的信噪比≥10，通过计算，得出仪器检出限为 1 μg·kg-1，仪器定量限为 5 μg·kg-1。

2.3.2 回收率及精密度

分别取17-F701虾粉、17-T228虾粉样品各3.00 g，在样品中分别添加0.1 mg·L-1四环素标准物质使用液1.00 mL，按照上述方法操作上机测定，计算6组浓度的回收率及精密度，结果见表1。

表1 方法回收率及精密度结果表

2.3.3 样品与加标回收色谱图

分别将处理好的样品与加标样品在上述条件下进行测定，得到样品与加标回收色谱图，见图1。

图1 样品与加标回收色谱图

2.4 数据分析

虾粉样在考虑回收率的情况下，计算出17-F701虾粉样四环素含量为94.0 μg·kg-1，17-T228虾粉样四环素含量为124.0 μg·kg-1，对17-F701虾粉样做重复性实验，相对标准偏差为5.8%。对17-T228虾粉样做重复性实验，相对标准偏差为9.4%。

3 结论

通过此次能力验证，本实验室充分利用现有资源，按照《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》（GB/T 21317—2007）进行处理，并对前处理方法、色谱质谱条件进行优化，最终选择0.2 mL·min-1的流速、柱温35 ℃、WATERS UPLC C8-3（100 mm×2.1 mm，5 μm）色谱柱为最佳色谱分离条件。配制不同浓度四环素标准溶液上机测试，并求出回归方程，线性良好，R2=0.998 914。对比空白虾样和添加四环素的虾样，差异明显，对回收率和精密度进行分析，回收率为85%～103%，相对标准偏差为5.8%～9.4%。能力验证显示17-F701虾粉样品Z值为+1.1，17-T228虾粉样品Z值为+0.8，均达到满意结果。实验结果表明，优化后该方法可以达到准确的分析效果，更加节约检测时间和检测成本，适用于虾中四环素类药物的测定。