不同贮藏条件下7种青冈属种子含水量及生活力变化研究

史喜兵， 焦雪辉， 申潇潇， 梁 冠， 周小娟， 刘 杰

(郑州市农林科学研究所， 河南 郑州 450005)

种子是植物的原始体和遗传信息的储存体，了解植物种子的贮藏特性对植物种质资源引种及保存至关重要[1-2]。影响种子贮藏特性的因素很多，内因主要为种子的物理性状(种子大小、种皮结构、硬度等)和化学组分(糖类、蛋白质和脂肪三大贮藏物质及含水量等)；外因包括采种母株的发育情况、采收、贮藏环境等[3]。多年来，国内外学者对种子的贮藏特性研究得非常广泛深入。大量的研究已经证明, 种子采集后的贮藏环境对种子性能的维持或改变有着极大的影响[4]。王培蒂和秦国峰[5]将马尾松种子在2～4 ℃下贮藏11年，证明低温有利于种子的长期贮藏；Ellis等[6]将芝麻种子的水分从5%降至2%，其贮藏寿命增长40倍，证实超干贮藏能有效提高种子耐贮藏性。张俊杰等[7]对金丝李种子的贮藏特性和脱水耐性进行了研究，认为4 ℃湿沙藏(含水量7.5%) 是短期贮藏其种子的较好方法。杨洪涛等[8]研究了贮藏方式和时间对云南越桔种子萌发的影响，得出低温干燥贮藏为最适合的贮藏方式。

根据种子特征和贮藏目的，贮藏方法一般可分为干藏和湿藏。大多数针、阔叶树种的种子均采用干藏法进行短期(如秋采冬贮春播)贮藏。长期贮藏大量种子一般采用低温冷藏或者超干燥贮藏。此外，种子低温库多采用液氮保存，以最大程度地延长种子寿命而不产生遗传变异。湿藏一般适用于含水量高的种子，如壳斗科、七叶树、核桃、油茶等树种。而且一般情况下湿藏还可以逐渐解除种子休眠，促进种子萌发[9]。这种现象在一些冻土地带植物[10-11]和许多温带植物[12]中都被观察到，但也有研究表明，低温湿藏会降低种子萌发能力[13]。

青冈属植物为常绿阔叶珍贵用材树种，目前研究较多的为青冈栎和赤皮青冈，其主要繁殖方式仍为播种繁殖。青冈属种子一般在每年11月份成熟，需要贮藏4～5个月才能播种。种子不经历成熟脱水，脱落时含水量相对较高，不耐干燥。种子贮藏过程中，因贮藏条件如温度、水分的变化，将会引起种子内部物质变化，从而影响种子质量和生活力。前人对青冈栎的贮藏方法进行了一些研究，陈彦君等[14]采用湿藏与干藏两种方法进行贮藏，通过对比发芽率及各项生理生化指标，认为湿藏有利于提高青冈栎种子发芽率和发芽势。彭颖姝等[15]认为低温沙藏后青冈栎种子透气性增加，种子发芽率高于常温沙藏。目前尚未有对青冈属多个树种贮藏特性的对比，也未见对不同贮藏方式下种子生活力变化的报道。为了解青冈属种子在不同方式贮藏过程中含水量及生活力变化，以及含水量和生活力之间的关系，本试验采用4种贮藏方法，测定120 d内不同树种含水量和生活力变化，探讨其贮藏特性，为青冈属种子采后贮藏提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

当年采集青冈属植物种子，包括青冈栎(Cyclobalanopsisglauca)、小叶青冈(Cyclobalanopsismyrsinaefolia)、细叶青冈(Cyclobalanopsisgracilis)、赤皮青冈(Cyclobalanopsisgilva)、曼青冈(Cyclobalanopsisoxyodon)、多脉青冈(Cyclobalanopsismultinervis)和云山青冈(Cyclobalanopsissessilifolia)，挑选饱满、无病虫害、大小一致的种子，洗净晾干。

1.2 种子形态测定

1.2.1种子百粒重

先将种子混合均匀，用四分法随机取样，取100粒种子，用电子天平称重，重复3次，取平均值。

1.2.2种子外部形态

随机抽取10粒种子(一级种子)，用游标卡尺测种子横径、种子纵径、种脐宽度种壳厚度等形态指标，并计算种子的长宽比(纵径/横径)。

1.3 含水量及生活力测定

种子用以下4种方法贮藏：室内常温贮藏(干藏)，室内常温湿沙贮藏，5 ℃冷藏(干藏)，5 ℃湿沙贮藏，沙湿度20%。分别在贮藏0 d，10 d，20 d，30 d，45 d，60 d，90 d，120 d后测定种子含水率和生活力。

1.3.1种子含水量测定

参照GB 2772-1999 林木种子检验规程[16]中测定种子含水量的方法。大粒种子(每千克少于5 000粒)以及种皮坚硬的种子，先将种粒切成小片。粒径≥15 mm的种子切成4片或5片，切片动作要快。用直径≥8 cm的样品盒，提前烘干并称重(M1)。将切好的种子(10 g左右)放入样品盒中，称量样品盒和鲜重(M2)。放入烘箱中，先用70 ℃烘4 h后，然后再(103±1)℃烘4～5 h，烘至恒重，称量样品盒和干重(M3)。

种子含水量(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%。

每个树种重复3次，求平均值。

路面的经过一段时间的反复使用之后，检测该路面是否出现裂痕是判断该路面是否需要进行路面养护的一大前提。而同步碎石封层技术经过了长期的实践检测，显现出路面抗裂性能高的特点，大大迎合了社会发展的需求。在以往的路面封层技术中，路面往往经历约3～5年左右就开始出现裂纹，而使用同步碎石封层技术养护过的路面是一般道路养护寿命的2～5倍，极大的增强了道路的使用寿命[2]。

1.3.2种子生活力测定

以曼青冈种子为试验材料，选用TTC和MTT两种染色剂，染色温度设置2个梯度(25 ℃和30 ℃)，染色时间设置3个梯度(6 h，12 h和24 h)。筛选出生活力测定最佳方法。

浸种、切取胚方：将青冈种子温水浸种24 h后，剥去果皮和种皮，切取0.5～1 cm2包括胚根、胚轴及部分子叶的方块，切好的方块先放入盛有清水或垫有湿滤纸的培养皿中，待全部剥完后一起放入TTC溶液中。

显色：将处理好的20个胚方置于烧杯中，根据筛选出的最佳染色剂、染色时间和染色温度加入染色剂，以刚好浸没胚方为宜，于恒温光照培养箱中黑暗染色。另取经相同方式处理得到的胚方，于沸水中煮10 min，再加入染色剂中置于相同的恒温条件下染色4 h。

统计：染色结束后立即进行鉴定，因放置太久会褪色。倒出TTC溶液，用清水将胚方冲洗2次，摆放在铺有湿滤纸的培养皿中，保持湿润。观察胚方被染色情况，按GB 2772-1999《林木种子检验规程》测定方法分别测定不同种源种子的生活力。每个处理15粒种子，重复3次，取平均值。

表1 试验设计Table 1 Experiment design

2 结果与分析

2.1 种子外部形态分析

表2 不同树种种子形态指标Table 2 Comparison of seed morphological indexes among different tree species

2.2 不同贮藏方式对种子含水量的影响

贮藏方式和贮藏时间会对种子的含水量造成影响。图1显示，7个树种种子的初始含水量都比较高，均在39%以上，其中曼青冈和细叶青冈含水量最高，分别为47.80%和46.25%，云山青冈和赤皮青冈含水量最低，分别为39.37%和40%。种子的初始含水量从高到低依次为曼青冈、细叶青冈、多脉青冈、青冈栎、小叶青冈、赤皮青冈、云山青冈。7个树种的种子在不同贮藏方式下含水量变化趋势类似。在5 ℃沙藏条件下，所有树种的种子含水量下降平缓，且下降幅度很小，贮藏120 d后含水量均保持在34%以上,曼青冈仍然最高，为42.58%。青冈栎、细叶青冈、曼青冈、云山青冈种子在常温沙藏和5 ℃冷藏条件下含水量变化趋势相似，贮藏120 d后，4种植物种子含水量均在20%以上。小叶青冈、赤皮青冈和多脉青冈3个树种在5 ℃干藏条件下含水量下降比较平缓，但是在常温沙藏条件下，贮藏60～90 d含水量骤降，90 d以后含水量又趋于平缓。7个树种在常温贮藏条件下，种子失水最快且最明显。青冈栎、细叶青冈、曼青冈和多脉青冈常温贮藏10 d内含水量下降最明显，尤其是曼青冈和多脉青冈，10 d后种子含水量下降了50%左右，30 d后种子含水量下降到15%以下。30 d以后含水量变化趋于平缓，120 d时含水量降至5%左右。小叶青冈、赤皮青冈和云山青冈常温贮藏30 d后含水量下降最明显，尤其是小叶青冈，贮藏30 d时含水量降至8.89%，30 d后含水量变化趋于平缓，120 d时含水量降至5%左右。

由此看出，在5 ℃沙藏条件下贮藏120 d，种子含水量保持得最稳定，大部分树种的种子几乎没有失水现象。在5 ℃干藏条件下贮藏120 d，种子含水量曲线下降平缓，最终含水量可以保持在27%以上。在常温沙藏条件下贮藏120 d，种子在贮藏60 d后含水量下降比较明显，最终含水量除多脉青冈外均保持在20%以上。在常温条件下贮藏120 d，种子失水最快最严重，在贮藏60 d后所有树种种子含水量降至10%以下，小叶青冈和云山青冈在贮藏30 d后含水量已降至8%左右，贮藏120 d后所有树种种子含水量仅为5%左右。因此，青冈属植物种子采种后可采用5 ℃沙藏方式进行贮藏，以保证种子的含水量。

2.3 不同贮藏方式对种子生活力的影响

2.3.1生活力测定方法的筛选

TTC染色法是林木种子生活力检测常用的方法，除此之外，MTT染色法应用也比较广泛。通过对比不同染色剂浓度、染色温度和染色时间，发现在将胚方全部灭活后(T0、M0)，M0处理的种子仍有个别被染色，说明被灭活的种子仍然有被MTT染色的可能，因此MTT染色对于检测青冈属种子生活力存在一定的不准确性。尽管在M1和M2处理下种子染色效果很好，但是仍然不适合作为检测青冈属种子生活力的最佳方法。T0处理的种子全部未染色，说明灭活的种子不能被TTC染色，TTC对青冈属种子生活力检测准确性较高，因此可以作为检测青冈属种子生活力的方法。

对比T1和T2处理，可以看出在30 ℃条件下进行染色，颜色比25 ℃条件下深，染色效果更好。对比T2、T3和T4处理，发现染色24 h效果最好，种子全部被染色且颜色明显；染色12 h后，有部分种子染色，部分种子颜色不明显，颜色较浅；染色6 h后红色最浅，不容易分辨。对比T2和T5，发现0.5%和1.0%的TCC染色24 h后均能使所有种子颜色变红，但是高浓度的TTC染色效果更好。因此选用T2处理对种子生活力进行测定。

2.3.2不同贮藏方式下种子生活力变化

由图2看出，不同贮藏方式对青冈属种子生活力影响差异显著。7种青冈属植物在5 ℃沙藏条件下，种子生活力持续时间最长，在贮藏120 d后生活力均在80%以上，其中青冈栎、小叶青冈、细叶青冈的生活力一直稳定在100%。7种青冈属植物在常温贮藏条件下，种子生活力持续时间最短，在贮藏20 d后所有种子均无活力。

图2 不同贮藏方式下7种青冈属种子生活力的变化Fig.2 Changes of vitality in 7 species of Cyclobalanopsis seeds under different storage methods

表3 不同处理下种子染色情况Table 3 Comparison of seed dyeing under different treatments

不同树种在5 ℃冷藏和常温沙藏条件下种子生活力变化不尽相同。前20 d内青冈栎在常温沙藏和5 ℃冷藏条件下种子生活力均为100%，30～90 d常温沙藏种子生活力骤降，最终降至0；5 ℃冷藏条件下贮藏45 d时种子生活力降至66.67%，45～120 d缓慢下降，最终为50%。小叶青冈在5 ℃冷藏和常温沙藏条件下生活力变化趋势相似，最终生活力分别为50%和33.33%。细叶青冈和云山青冈情况相似，在5 ℃冷藏和常温沙藏条件下生活力均是缓慢下降，最终生活力都在20%以上。赤皮青冈在常温沙藏条件下，贮藏60 d生活力仍能达到100%，但后期生活力迅速下降，120 d时生活力仅为16.67%。曼青冈和多脉青冈生活力变化曲线相似，在常温沙藏条件下，贮藏45～60 d后生活力仍能达到100%，但后期生活力迅速下降，最终降为0；5 ℃干藏条件下，生活力逐步下降，最终分别降为16.67%和0。

3 讨论与结论

以种子的脱水耐性评价种子的贮藏生理行为已被广大种子生物学家认可[17]。其中顽拗性种子因不耐脱水而被称为脱水敏感性种子[18]。Hong和Ellis[19]认为，千粒重超过1 300 g的种子极有可能是顽拗性种子。就种子大小而言, 顽拗性种子的二维尺度多数介于6 mm×5 mm和43 mm×42 mm之间[20]。本研究中青冈属种子的千粒重均在1 300 g以上，种子大小均在16 mm×11 mm以上，从种子形态来看，青冈属种子应属于顽拗性种子。

研究发现，正常性种子可大量失水，甚至可脱水至5%而不发生明显的伤害，中间性种子可脱水至7%～12%，而顽拗性种子不能经受严重的脱水[21]。本研究中几种青冈属植物的初始含水量均在40%左右，在干藏条件下，伴随着种子含水量的降低，种子活力也在下降。在常温干藏条件下种子含水量下降速度较快，贮藏20 d时，尽管大部分种子含水量仍保持在14%以上，有的甚至在25%以上，但是种子已经完全丧失活力。在低温干藏条件下，尽管种子含水量的下降速度很缓慢，但种子贮藏30 d后仍然出现了活力快速下降的现象。说明干燥脱水直接导致青冈属种子劣变而降低了活力。因此，本研究中的几种青冈属种子属于脱水敏感性种子，不适合进行干藏。从中还可以看出，低温条件下，种子生活力的变化是一个逐渐下降的过程，随着贮藏时间的延长，种子生活力逐步降低，且在贮藏120 d内，没有出现所有种子均丧失活力的现象，即使是低温干藏，仍然会有部分种子能保持活性。而在常温条件下，种子生活力是一个急剧变化的过程，常温贮藏时随着种子含水量的下降，种子活力迅速下降；常温沙藏时，尽管贮藏前期种子仍能保持较高的活力，但是后期活力迅速下降。因此常温贮藏不适合青冈属种子的长期保存。

除了对脱水敏感外, 顽拗性种子通常易受低温伤害。大多数顽拗性种子对零上低温比较敏感。苏铁种子在4 ℃中层积6个月或24周后依然能保持很高的活力，表明苏铁种子有较强的耐受零上低温的能力[22]。也有研究表明，栎属等温带性植物所产生的顽拗性种子在2 ℃下冷藏8个月后仍能萌发[20]。张俊炎[23]认为赤皮青冈属于顽拗性种子，在整个生长过程以及脱落母体后，始终保持对脱水的敏感性。成熟脱落时代谢相对活跃，脱离母体后的生长状态不断变化，因此种子采收后需要通过严格的保存机制来维持其活力。这与本研究的结果一致。本研究中青冈属种子在低温沙藏条件下贮藏120 d后，种子含水量能保持在36%以上，生活力仍然能保持在80%以上，远远高于其他贮藏方式。 而且低温沙藏对打破青冈属种子休眠也有一定的促进作用。因此，对于本研究中的青冈属种子来说，低温沙藏相较于其他方法，最适合种子播种前的保存。