PDMDAAC改性玉米醇溶蛋白负载阿维菌素纳米颗粒的制备与性能

李梓泳，陈龙，马文丹，周红军，周新华，2

（1 植物健康创新研究院，仲恺农业工程学院化学化工学院，广东省普通高校农用绿色精细化学品重点实验室，广东 广州 510225；2 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东 茂名 525000）

农药是一类重要的农业生产资料，可用于防治病虫害、调节作物生长、提高农产品收成。传统的农药制剂存在粉尘漂移、有机溶剂和表面活性剂使用量大、利用率低等问题。据统计，在农药喷施的过程中，农药的分解率高于50%，最终在作物中起效的不到10%。使用载体将易分解的农药包封起来可降低农药的分解率并优化其性能，达到提高利用率的目的。纳米农药是一种新兴的农药传递系统，具有小粒径、高比表面积的特点，易被靶标生物吸收。纳米农药可减轻紫外光、氧气、微生物等分解作用，从而提高制剂稳定性，延长药效。Hao 等报道了一种功能化的二维氮化硼纳米片作为高水分散性的农药纳米载体，具有明显的pH 响应和抗紫外线照射等性能。Chen等利用改性修饰后的纳米介孔硅制备了使用寿命长的环保型缓释生物农药，以减少农药对环境造成的破坏。Zhao等设计了壳聚糖为基材的纳米农药颗粒，能在黄瓜叶片上较好地铺展并具有较高的黏附性。

因为蛋白质（大豆蛋白、玉米醇溶蛋白、羽毛蛋白等）、多糖（木质素、纤维素、壳聚糖）等天然聚合物来源丰富、无毒和可生物降解，被广泛应用于纳米农药。玉米醇溶蛋白是玉米胚乳中的主要蛋白质，具有独特的溶解特性使其可通过简单的方法得到纳米粒子，是一种有前景的新型纳米载体材料。玉米醇溶蛋白具有疏水性、生物相容性、生物可降解性和能自组装成纳米颗粒的特性，用于各种疏水化合物、药物、维生素和膳食补充剂的包埋和传递。玉米醇溶蛋白纳米颗粒易在溶液状态下聚集，对其进行阳离子改性可提高分散性，且有利于与植物叶面形成静电作用，提高其润湿性能。Hao 等使用羧甲基纤维素钠（CMC）接枝甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸羟乙酯的共聚物，最后通过开环作用与乙二醇二缩水甘油醚改性过的Zein 反应，制得的农药纳米颗粒有较高载药率，但该方法改性步骤相对复杂。二甲基二烯丙基氯化铵（DMDAAC）是一种具有较高实用价值的阳离子单体，具有分子量易于控制、杀菌性能好、价格低廉、无毒、正电荷密度高等优点。Liu 等使用带正电荷的DMDAAC 接枝CMC 作为阴离子农药的载体，具有多种环境响应功能，提高了农药的利用效率。邱松发等利用乳液聚合把DMDAAC 和甲基丙烯酸甲酯的共聚物改性CMC，赋予农药较强的缓释性能，减少了农药用量。

本文利用PDMDAAC对Zein进行改性，制备一种纳米农药载体，并负载了阿维菌素。利用FTIR、SEM、DLS 动态光散射激光粒度仪、zeta 电位仪和接触角仪对纳米颗粒进行了表征，分析了不同接枝量下AVM 的释放情况，比较了原药和纳米农药颗粒叶面上的滞留量，证明该纳米农药载体可以增强AVM的抗紫外性能。

1 实验部分

1.1 实验材料

玉米醇溶蛋白（Zein）、氢氧化钠（分析纯），上海麦克林生化科技有限公司；二甲基二烯丙基氯化铵（DMDAAC），分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿维菌素（AVM），工业级，纯度为95%，河北威远生物化工有限公司提供；溴化钾，分析纯，广州化学试剂厂；浓盐酸、过硫酸钾（KPS）、无水乙醇，均为分析纯，天津大茂化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

紫外可见分光光度计，T6 型，北京新世纪有限公司；傅里叶变换红外光谱仪，Spectrum100型，美国赛默飞世尔科技公司；激光粒度仪，90 Puls型，英国马尔文仪器有限公司；分析天平，SQP型，上海精科天美科学仪器有限公司；接触角仪，Theat 型，瑞士百欧林仪器公司；旋转蒸发仪，RV10型，德国艾卡公司。

1.3 聚二甲基二烯丙基氯化铵-玉米醇溶蛋白（Zein-g-PDMDAAC）的制备

2g玉米醇溶蛋白溶解在50mL 70%乙醇水溶液中。0.5g KPS溶于10mL去离子水，得到KPS溶液，取2mL 加入玉米醇溶蛋白溶液中搅拌5min；10mL 12%二甲基二烯丙基氯化铵溶液与剩余KPS溶液分别用恒压滴定漏斗滴加至引发的玉米醇溶蛋白溶液中，在回流条件下继续反应4h，反应全程通入氮气保护。反应结束后旋转蒸发除去乙醇，调节pH至13，离心取上清液，冷冻干燥得到Zein--PDMDAAC 产品，称重。调整DMDAAC 的质量分数为12%、24%、36%，得到具有不同接枝率的产品 Zein--PDMDAAC-1、 Zein--PDMDAAC-2、Zein--PDMDAAC-3，具体见表1。合成机理如图1所示。

表1 不同单体配比及接枝率

图1 Zein-g-PDMDAAC合成示意图

1.4 Zein-g-PDMDAAC@AVM的制备

AVM原药溶解在无水乙醇中，制备10mg/mL的AVM乙醇溶液。分别取0.1g的Zein--PDMDAAC-1、Zein--PDMDAAC-2、Zein--PDMDAAC-3 溶 于3mL 70%乙醇水中，加入2mL AVM 乙醇溶液，将上述溶液加入95mL 去离子水的棕色锥形瓶中，搅拌30min得到Zein--PDMDAAC@AVM。

1.5 结构表征及性能测试

1.5.1 傅里叶红外光谱（FTIR）

采用KBr压片法，在450～4000cm光谱范围内扫描，分辨率为2cm。

1.5.2 扫描电镜（SEM）

将Zein--PDMDAAC 样品置于样品台上，吹干，在固体样品的表面喷金。在氮气保护下，加速电压为5kV时观察其微观结构。

1.5.3 粒径和zeta电位

取去离子水释至低浓度的Zein--PDMDAAC溶液于比色皿中，用动态光散射技术测定样品的平均粒径和zeta电位。

1.5.4 包封率测试

取4mL 新鲜制备的Zein--PDMDAAC@AVM于离心管中，12000r/min 离心10min。用移液枪移取1mL 上清液置于25mL 棕色容量瓶中，用无水乙醇定容。在波长为245nm 的紫外分光光度计下测定游离AVM 的吸光度。根据标准曲线公式=0.03037+0.00207（²=0.9997）计算AVM 的浓度，按式(1)计算对AVM的包封效率（，%）。

式中，为体系AVM 总质量，g；为体系中未包封的阿维菌素质量，g。

1.5.5 接触角和叶面滞留量测试

配制2mg/mL的样品溶液和AVM溶液，采用光学接触角仪测量在黄瓜叶片上的接触角。黄瓜叶片采摘后用去离子水冲洗干净，放置干净的玻片上晾干。用微量进样器将不同样品的溶液滴到叶子表面，记录30s后的接触角，每种样品在叶片部位进行4次重复操作。

将冲洗后晾干的叶片裁成2cm×2cm，浸泡在样品溶液15s后，用镊子垂直提起至无液滴落下，放置分析天平称重。滞留量（LHC）的计算如式(2)。

式中，和分别表示浸泡前后叶片的质量，mg；表示叶片的表面积，cm。

1.5.6 抗紫外性能测试

将 Zein--PDMDAAC@AVM 和 10mg/mL 的AVM乙醇溶液分别用去离子水稀释至100mg/L。将50mL不同的样品溶液（100mg/L）同时放置在距离紫外光光源15cm 的光化学反应器中，用300W 汞灯照射（=365nm）。在一定的时间内，移取1mL 样品到棕色容量瓶中，用去离子水稀释至10mL，并用紫外分光光度计测量245nm 处的吸光度。根据标准曲线公式=0.0317-0.00456（=0.998）算出AVM 的浓度，按式(3)计算对AVM 的残留率（，%）。

式中，为AVM在溶液中的初始浓度；为不同光照时间后样品中的AVM浓度。

1.5.7 缓释性能测试

取Zein--PDMDAAC@AVM（5mL）于透析袋内并置于100mL 棕色锥形瓶。加入50mL40%乙醇水溶液作为释放介质，锥形瓶置于26℃的摇床上。在一定的时间间隔内取1mL 缓释液于棕色容量瓶中，用40%乙醇水溶液稀释至10mL。同时，将等体积的释放介质重新加入锥形瓶中，用紫外分光光度法在245nm处测定稀释后的溶液的吸光度。按照标准曲线计算样品在锥形瓶中的浓度，计算公式为=0.027348+0.00242（=0.9996）。然后根据式(4)计算AVM的累积释放率（R，%）。

式中，C为每个样品在不同时间间隔时AVM的浓度，mL；为锥形瓶中AVM的总质量，g。

2 结果与讨论

2.1 傅里叶红外光谱

如图2 所示，Zein 的曲线在1660cm出现酰胺Ⅰ带的吸收峰和1540cm处出现酰胺键Ⅱ带的吸收峰，N—H 弯曲振动峰吸收和C—N 吸收拉伸振动峰都出现在1450cm处；在DMDAAC 的曲线中，1647cm和1008cm处分别为C==C 和C—N 的伸缩振动峰，960cm为C—H 的吸收峰，1476cm处为与N键合的两个甲基的特征峰；在Zein--PDMDAAC的曲线中，与N键合的两个甲基的特征峰出现在1480cm处，1540cm酰胺Ⅱ带的吸收峰消失，说明PDMDAAC接枝成功。

图2 Zein、DMDAAC和Zein-g-PDMDAAC的红外光谱图

2.2 扫描电镜分析

疏水的Zein在亲水的PDMDAAC改性后，在水中可通过自组装方式形成球状颗粒，如图3(a)所示，Zein--PDMDAAC 呈圆形或椭圆形；使用Image-Pro Plus 软件对颗粒粒径进行计算，结果如图3(b)所示，平均粒径在85nm 左右。与DLS 粒径有差异，可能是由于两种技术所涉及的原理不同，纳米颗粒在DLS 测量时分散在水中，而SEM 测试则处于一个干燥的状态。

图3 Zein-g-PDMDAAC的扫描电镜图及其粒径分布图

2.3 粒径、zeta电位、包封率分析

如表2 所示，因为DMDAAC 带正电荷，所以随DMDAAC加入量增加，电荷值由(18.01±0.86)mV增大到(27.71±1.30)mV；Zein 是一种亲水基团较少的蛋白，当加入的DMDAAC 量较少时，颗粒容易团聚，故Zein--PDMDAAC-1@AVM 的粒径较大；颗粒所带正电荷越多，颗粒间的静电排斥力越强，稳定性越好，不易发生团聚，降低了颗粒大小；DMDAAC 具有交联作用，随着DMDAAC 加入量增加，其接枝率上升，颗粒的紧密程度也随之增加，在水中的溶胀程度会较小，不利于捕获AVM，故Zein--PDMDAAC-3@AVM的包封率也相对较低。

表2 不同DMDAAC添加量的Zein-g-PDMDAAC@AVM的粒径、电位、包封率

2.4 接触角分析

图4 为水、 AVM 乙醇水溶液、 Zein--PDMDAAC@AVM 样品在黄瓜叶片上的接触角图，水的接触角大于90°，AVM乙醇水溶液的接触角也接近90°，说明黄瓜叶片不能被两者润湿。Zein--PDMDAAC-1的接触角比水的小，说明其能改变水的表面张力。随着DMDAAC 添加量的增大，Zein-PDMDAAC 的接触角由77.38°减小到64.60°，因为黄瓜叶面含有带负电的脂肪醇和脂肪酸，Zein--PDMDAAC 电位的增大，与叶片的静电作用力增强，故接触角减小。

图4 水(Ⅰ)、AVM乙醇水溶液(Ⅱ)、Zein-g-PDMDAAC-1@AVM(Ⅲ)、Zein-g-PDMDAAC-2@AVM(Ⅳ)、Zein-g-PDMDAAC-3@AVM(Ⅴ)在黄瓜叶片上的接触角图

2.5 叶面滞留

农药在喷施的过程中，因作物表面的脂质层或蜡质层，农药液滴易滚落会导致滞留量小。如图5所示，黄瓜叶片上的滞留量结果和表面张力测试一致，Zein--PDMDAAC@AVM 比水的叶面滞留量明显增大，其中Zein--PDMDAAC-3@AVM 的滞留 量 为33.69mg/cm。 一 方 面， 带 正 电 荷 的PDMDAAC 与叶片存在静电作用；另一方面，Zein--PDMDAAC-3 的粒径小，比表面积大，进一步增强了与叶面的相互作用。因AVM 乙醇水溶液中含有乙醇，在叶片上的润湿性较好，其叶面滞留量也会提高。

图5 水(Ⅰ)、AVM乙醇水溶液(Ⅱ)、Zein-g-PDMDAAC-1@AVM(Ⅲ)、Zein-g-PDMDAAC-2@AVM(Ⅳ)、Zein-g-PDMDAAC-3@AVM(Ⅴ)在黄瓜叶片上的滞留量

2.6 抗紫外性能

杀虫剂在应用于农作物时可能会受到强烈太阳光照射，所以开发抗紫外线的农药制剂是必要的。如图6 所示，在紫外灯照射下，未包封的AVM 降解率较高，在15min 左右已经降解一半，在70min 时最终剩余13.9%，而被Zein--PDMDAAC包封的AVM 的半衰期则从15min 延长到40min，Zein--PDMDAAC-1、 Zein--PDMDAAC-2 和Zein--PDMDAAC-3 的半衰期分别为40min、46min 和47min，在70min 时的剩余率都高于26.9%，明显提高了AVM的抗紫外性能。这是因为Zein--PDMDAAC 为AVM 提供了一个物理屏障外壳，隔绝了紫外线的照射，Zein含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，这些氨基酸的单元中的芳香基团和双键可以吸收紫外线，阻碍了AVM的降解。

图6 未包封阿维菌素及不同配比的Zein-g-PDMDAAC@AVM的抗紫外图

2.7 缓释性能

图7 为加入不同量的DMDAAC 的缓释曲线。曲线的走势可分为3个阶段，从开始到第9h的释放速率较快，因为部分黏附在Zein--PDMDAAC 颗粒表面的AVM 释放到缓释体系中；在第24h 时，Zein--PDMDAAC-1 的累积缓释率为54%，Zein--PDMDAAC-2 和Zein--PDMDAAC-3 的 累积缓释率相差不大，分别为67%和69%，因为单体的接枝量较大，亲水组分比例上升，降低了颗粒内部的疏水作用，故其释放速率较快；最后进入平台期，累积缓释率变化不大，Zein--PDMDAAC-1、Zein--PDMDAAC-2和Zein--PDMDAAC-3的最终缓释率为57%、79%和75%。

图7 不同配比的Zein-g-PDMDAAC@AVM的缓释图

2.8 缓释动力学分析

为进一步研究样品的释放模式，采用Zeroorder、Higuchi、First-order 等动力学模型进行药物缓释数据拟合。结果如表3和图8所示，用相关系数来确定各拟合曲线的适用性，其中First-order模型的相关程度最高，说明纳米颗粒释放AVM 是因为颗粒内部和外部的浓度差，First-order 公式的和分别表示药物的最大释放能力和持续释放速率。

表3 模型拟合参数

图8 不同pH下的缓释拟合模型

3 结论

将PDMDAAC接枝玉米醇溶蛋白，制备了不同接枝量的阿维菌素纳米颗粒。接枝量最高的Zein-PDMDAAC-3@AVM 的包封率为34.75%，zeta 电位值大，具有较好的稳定性；其接触角为64.60°，滞留量为33.69mg/cm，提高了阿维菌素叶面沉积率；经Zein--PDMDAAC 纳米颗粒包封后，AVM的半衰期从15min 延长到40min。纳米颗粒的缓释数据与First-order 相关性较高，受PDMDAAC 的接枝量调控。该阿维菌素纳米颗粒具有良好的缓释性能和环境友好性。