氧化石墨烯和过渡金属碳/氮化合物固定化酶

毛梦雷，孙丹阳，孟子晖，刘文芳

（北京理工大学化学与化工学院，北京 102488）

酶作为一种重要的生物催化剂，所催化的反应具有条件温和、高效性、专一性等优点。但同时，游离酶稳定性较差，无法长期维持其催化活性，使得酶催化反应工业化受限。固定化酶是通过物理或化学作用将酶固定在载体材料上的一种技术。通常，固定化酶的稳定性较游离酶高，易于分离和重复利用，可降低生产成本。固定化载体和固定化方法是固定化酶技术的两个关键点。通常，固定化方法视载体而定，包括包埋法、物理吸附法、共价连接法、交联法等。载体的结构、物理和化学性质、表面官能团的种类及数量都会影响酶的固定化。传统的固定化载体包括海藻酸钠、几丁质、壳聚糖、甲壳素、纤维素、淀粉等天然有机材料，聚氨酯、大孔树脂等合成有机材料，硅胶、硅藻土、玻璃、二氧化硅、氧化铝、介孔二氧化硅、介孔分子筛等无机材料，磁性高分子微球等复合材料。天然有机材料机械强度低、容易生物降解、寿命短、来源受产地限制；合成有机材料传质性能差、固定化酶的活性和稳定性不高、操作步骤复杂、难度大。传统无机材料具有结构不易调整、表面官能团匮乏等缺点。复合材料制备过程复杂，工艺要求高，成本高。因此，固定化酶技术仍面临巨大挑战。相较于传统固定化酶载体，二维纳米材料机械强度高、不会被生物降解、比表面积高、表面官能团丰富、易与酶形成稳定结构。二维纳米材料的出现为固定化酶的进一步发展带来了曙光。

2004 年，石墨烯问世后，叩响了二维纳米材料的大门。二维纳米材料是指具有片状结构以及高度各向异性和化学功能的一类超薄纳米材料。由于具有高的纵横比、量子尺寸效应和平面构象，二维材料具有许多独特的性能。例如，电子传输可限定在二维结构内；超薄的原子厚度和强的面内化学键赋予材料高的机械强度、柔韧性和光学透明性；大的水平尺寸赋予材料超高的比表面积；材料表面大量的原子使得易于表面工程化，通过活性位点的构建来增强材料自身的性能等。二维纳米材料具有优异的电学、光学、磁学、力学和化学性能，已广泛应用于电池、超级电容器、储能、催化、吸附分离、传感和生物医学等领域。

到目前为止，已经开发了数百种二维材料，如石墨烯、硅烯、锗烯、锡烯、硼烯、磷烯、砷烯、锑烯、铋烯、铪烯、氧化石墨烯（GO）、金属氧化物、过渡金属硫化物（TMDs）、过渡金属氧化物（TMOs）、六方氮化硼（h-BN）、石墨相氮化碳（g-CN）、过渡金属碳/氮化合物（MXenes）、层状双氢氧化物（LDHs）、二维金属有机框架（MOFs）、二维共价有机框架（COFs）、金属磷三卤代物、杂化钙钛矿等。其中，GO作为开发较早的经典二维材料，将其用于固定化酶的报道较多，而MXenes 作为新型二维材料的典型代表，近年来也受到越来越多的关注。从固定化酶的应用角度来看，二者均具有高比表面积、大量的活性位点、良好的亲水性以及生物相容性，是固定化酶的优异载体。因此，本文选取这两种材料，分别介绍它们的制备方法和结构、物理和化学性质，综述近年来它们在固定化酶领域的应用研究，并进行比较，最后指出存在的问题，对未来的发展方向提出展望。

1 氧化石墨烯

1.1 GO的制备方法和结构

氧化石墨烯（GO）是以C、H、O 为主要元素组成的二维材料，由石墨烯经化学氧化再剥离制得。化学氧化法主要有Brodie法、Staudenmaier法、Hofmann 法、Hummers 法和Tour 法。这五种方法制得的GO的各元素含量、比表面积、层间距和层数列于表1。Brodie 法制得的GO中O元素所占百分数最高，但是氧化剂中的发烟硝酸具有强腐蚀性，危险且耗时长，因此该法很少被利用。Tour法制得的GO的比表面积、层间距较大和剥离层数较少，并且安全快速，因而广受欢迎。Brodie 法、Staudenmaier法和Hofmann法制得的GO中羟基含量更高，热稳定性高，官能团在表面分布均匀。Hummers 法制得的GO 含有较多的酮基和羧基，导致石墨烯骨架的缺陷、空穴、碳碳键网络的整体破坏等，因此官能团在表面分布不均匀，并且酮基和羧基易分解，稳定性较差。Tour 法改进了Hummers法，去除了硝酸钠，增加了高锰酸钾的用量，添加了硫酸/磷酸混合物，极大地提高了氧化效率，因此表面的含氧官能团含量更高，更易剥离。总之，不同的氧化方法制得的GO 在组成、结构、性能等方面具有明显差异。

表1 各种氧化方法制得的GO的元素含量、比表面积、层间距和层数[28]

通常认为GO中C有sp、sp两种杂化方式，其中C==C 双键以sp杂化方式存在，C—O—C 以sp杂化方式存在。由于GO具有非化学计量组成、多变和无序的含氧官能团结构，人们提出了多种结构模型，包括Hofmann 模型、Ruess 模型、Scholz-Boehm 模型、Nakajima-Matsuo 模型、Lerf-Klinowski 模型、Dekany 模型、Ajayan 模型等（图1）。但这几种模型也饱受争议，仍需进一步探索。

图1 GO的结构模型[27]

1.2 GO的物理和化学性质

GO 具有高比表面积以及优异的电子、光学、机械、热稳定性和铁磁性等物理性质。GO 表面丰富的含氧官能团使其完美的晶格结构被破坏，以致sp碳网络结构中π-π 电子迁移受阻。这种结构缺陷及其原子结构决定了GO的导电性质，可通过控制GO 的氧化还原程度来调控其导电性。GO具有良好的电催化和高电容性。此外，通过电子、光子激发和化学修饰可以调控GO材料的发光性质。GO 材料中致密的π-π 堆积使其表现出优异的力学性能。GO 优异的物理性质使其在电池、催化、细胞成像、荧光传感、生物医学诊断等领域应用广受欢迎。

GO具有丰富的含氧官能团，如羟基、环氧基、羧基、羰基、酚基、醚基、内酯基、醌基等，其中环氧基、羟基位于面内，少量羧基、羰基、酚基、醚基、内酯基、醌基位于纳米片边缘。GO的含氧官能团可与多种化学物质通过共价键相连接，还可通过范德瓦尔斯键、氢键、π-π 作用、π-阳离子作用、疏水作用和静电作用等吸附到GO材料的表面，有利于GO的共价和非共价功能化，从而拓宽GO 的应用。此外，由于纳米片容易聚集，在GO片层间引入表面活性剂、功能化聚合物、富含芳香族的分子和离子液体等稳定剂，既可以克服纳米片间的范德瓦尔斯作用，又可避免纳米片堆叠。

1.3 GO固定化酶

GO 不仅具有高比表面积和优异的热稳定性、机械稳定性，还具有优异的亲水性、生物相容性、易功能化等特点，因此广泛应用于传感、固定化酶及生物医学等领域。固定化酶的途径通常有两种：一是共价结合法，即利用GO表面官能团，通过共价作用将酶结合到GO材料表面；二是物理吸附法，一方面由于GO表面大量的含氧官能团使其表面带负电，可通过静电吸附作用固定带正电荷的酶，另一方面也可通过氢键、疏水作用、π-π 作用等固定化酶。

1.3.1 共价结合法

首先，由于GO 表面富含羟基，因此，可以先通过硅烷化在载体表面引入氨基，再通过戊二醛（GA）固定化酶。Hosseini Salekdeh 等首先用改进的Hofmann 法制备GO，再引入Fe、Fe以磁性化；接着，用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）改性以引入氨基，再用GA活化；最后，通过共价键将模型酶PersiManXyn1 固定在改性的GO 材料上。酶被固定后，其构象、刚度、活性位点改变使得其动力学参数和均增大。固定化酶比活为1141.1U/mg，约为游离酶的1.333 倍。在50℃时，游离酶的活性最大，在20～70℃范围内，至少能保持最大活性的40%；固定化酶在50℃时的活性最大并且与游离酶差不多，在90℃时，活性仍为固定化酶活性最大值的35%以上。储存4周后，游离酶基本失活，固定化酶的活性仍能保持初始值的54%。将固定化PersiManXyn1 用于催化还原亚甲基蓝，循环利用15 次后，还原活性仍可达初始固定酶活力的94%以上。Kashefi 等采用类似方法固定漆酶，负载量达156.5μg/mg，固定化效率为64.6%。用于处理偶氮染料废水，在6 次循环催化脱色后，脱色率仍达固定化酶初始效果的70%以上。在硅烷化改性前用表面活性剂修饰载体可以有效提高脂肪酶的活性。王艳娥等首先采用化学共沉积法制备磁性氧化石墨烯（MGO），再用Span系列表面活性剂功能化MGO，接着用APTES改性以引入氨基，再通过GA固定化褶皱假丝酵母脂肪酶（CRL）。经表面活性剂修饰后，MGO 表面由亲水性转变为强疏水性，利用共价固定和疏水性界面活化同时作用，酶活性提高，固定化酶比活为32.5U/mg，固定化酶活回收率高达116.5%。在50℃时，游离酶和固定化酶的半衰期分别为3.8h 和10h。在储存5 天后，游离酶活性约为初始酶活的30%，固定化酶活力几乎无变化。在6次循环水解反应后，固定化酶仍能保持首次使用时活性的73.6%。

其次，利用载体表面的羧基和酰胺化反应来固定化酶也是一条常用路线。如果直接用GO表面的羧基与酶分子的氨基反应，羧基的反应活性不足，导致酶易从载体上脱落。通常采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化GO表面的羧基。Xie等首先用改良的Hofmann 法制备GO；接着，在碱性条件下将Fe、Fe通过化学共沉积法包裹进GO中，制备MGO；然后，在EDC 和NHS 存在下固定化脂肪酶，见图2。固定化酶效率和酶活回收率分别为85.5%和64.9%。在pH=7.0、30℃时，游离酶和固定化酶的活性最高。固定化酶热稳定性更好，在80℃时，游离酶几乎无活性，固定化酶活性约为其在30℃时活性的50%。在40℃时，固定化酶可以高效催化大豆油与甲醇的酯交换反应生成生物柴油，产率为92.8%，且循环使用5 次后，其活性基本不变。朱珣之等采用水热沉积法制备含有—OH和—COOH 的MGO，再用交联剂（,-亚甲基双丙烯酰胺、三聚氰酰氯或戊二醛）固定果胶酶。其中，利用戊二醛固定的果胶酶活性最高，催化氧化还原糖量达约0.34mg/mL。戊二醛质量分数达8%时，固定化效果最好，负载量达1453mg/g。超过50℃时，固定化酶仍可保持其在20℃时活力的40%以上。循环使用5次后，仍可达初始固定酶活力的58%。MGO 具有磁性，几乎可以完全回收利用。

图2 GO/Fe3O4纳米复合材料的制备及其固定化脂肪酶的示意图

再者，除了羟基和羧基之外，GO 表面还含有活泼的环氧基团，在室温下即可与脂肪族伯胺反应。Monajati等采用天冬氨酸（Asp）功能化GO，使环氧开环的同时引入羧基和亚氨基，然后用羰基二咪唑（CDI）活化羧基固定天冬氨酸酶，见图3。Asp对GO的预改性优化了载体的分散性和稳定性，同时，表面钝化避免了酶在载体表面直接吸附，有利于保持酶活。在20℃、40℃和60℃时储存24h后，酶活性分别为最初活性的100%、90.5%和40.6%。在8 次反应循环后，固定化酶活性为初始酶活的42%，比游离酶高13%。

图3 L-天冬酰胺酶在GO-天冬氨酸纳米复合材料上的共价固定化示意图[48]

1.3.2 物理吸附法

利用GO 表面带负电的特点，可通过静电吸附作用将带正电荷的酶固定到GO材料上。此外，氢键的形成也有利于增强固定。辣根过氧化物酶（HRP）的等电点pI=7.2，Zhang 等认为，在pH 4.8～7.2范围内时，带正电的HRP与带负电的GO通过静电作用相结合；在pH 4.8～8.8范围内时，HRP的氨基酸残基与GO表面的含氧官能团之间以氢键相连接。因此，在pH=7 时，HRP 与GO 之间以多种力相连接，强化了酶的固定，酶负载量达100μg/mg。与HRP 类似，溶菌酶（pI=10.3）也可通过静电作用、氢键等与载体结合，由于等电点较高，正电性较强，在pH=7 时，溶菌酶负载量高达700μg/mg。Besharati Vineh 等用HO还原GO，然后用HNNHCO修饰以引入氨基，再通过静电、氢键等物理吸附作用固定HRP。还可只利用GO表面的疏水作用固定化酶，Mathesh 等用L-抗血酸还原GO，使GO 的芳香性部分还原，增强材料疏水性，再固定脂肪酶。

为了改善酶的稳定性，也有人采用先包覆再吸附的方法固定化酶。Chen 等首先在-烯酰氧基琥珀酰亚胺（NAS）单体存在下采用原位自由基聚合法在有机磷水解酶（OPH）表面构建含氨基聚合物壳层， 以形成带正电荷的OPH 纳米球（NOPH10）；然后，NOPH10 通过静电作用吸附到带负电荷的GO 表面，见图4。在纳米球制备过程中，OPH 的构象发生变化，酶内部疏水基活性增强，疏水作用为OPH固定的主要驱动力。NOPH10聚合层中的—NH和GO 材料中的—OH 相互作用，使得催化效率提高，且可以适应缓冲环境中pH 的变化，为酶提供相对稳定的微环境。NOPH10的壳层可以稳定OPH 的构象，保护酶结构免受热效应的影响，故热稳定性大大提高。NOPH10@GO 在5次循环冷冻-解冻后仍可保持原活性的约75%，并且重复使用10 次后仍可保持原活性的90%以上。可进一步制成生物传感器，检测有机磷农药。

图4 新型生物无机催化界面的构建[51]

将GO 固定化酶的文献汇总后列于表2。通过比较发现， 采用相同的路线固定模型酶PersiManXyn1和漆酶，前者的可重复利用性更高。因酶种类不同及反应条件的差异，固定化脂肪酶的活力、稳定性、可重复利用性较模型酶PersiManXyn1 差，但是可重复利用性略高于漆酶。GO经Span系列表面活性剂和APTES硅烷偶联剂改性后再固定脂肪酶，有利于酶活性的提高，比不使用表面活性剂的固定化酶高31%。经Asp 修饰的GO 较改性之前含有更多的—COOH，因此，固定化天冬酰胺酶的效率高达100%。

表2 GO固定化酶的文献汇总

除了GO 外，石墨烯和石墨炔也有少量报道。Seelajoen 等在EDC、NHS存在下，利用酰胺化反应将甲醛脱氢酶（FaldDH）、 甲酸脱氢酶（FateDH）、乙醇脱氢酶（ADH）固定到羧基修饰的石墨烯表面。Wang 等通过非特异性吸附将柚皮苷酶固定到十二烷基硫酸钠（SDS）修饰的石墨烯微反应器上进行生物催化。在50℃、pH=7 条件下，酶负载量达4mg/mg。经SDS 表面活性剂修饰后，载体的分散性能得到改善，固定化酶与底物接触更完全，转化率比修饰前高60.66%；在10 次酶解反应循环后，可保持固定化酶初始活性的85.5%。Liu 等将葡萄糖氧化酶（GOx）吸附在Fe修饰的石墨二炔（GDY）上，用于检测血糖，在20～40℃时的活性可达pH=4.5、35℃时固定化酶最高活性的90%以上。总的来说，GO 是石墨烯的氧化衍生形式，二者结构相似，但是GO表面含有更为丰富的官能团，表面规整性、亲水性、稳定性等更加优异。石墨炔与石墨烯是同素异形体，是一种具有sp 和sp杂化键的新型材料，含有丁二炔和苯环等特有结构，目前研究还较少。

2 MXenes

2.1 MXenes的制备方法和结构

MXenes 是一类新型碳/氮化物二维纳米层状材料，一般是利用化学刻蚀的手段通过选择性刻蚀掉前体MAX 相中的A 原子层（A 主要为Ⅲ或Ⅳ族元素，如Al、Si、Sn 等）而得到，其通式可表示为MXT，其中M 代表早期过渡族金属，X 代表碳和/或氮，T代表在刻蚀过程中产生的附着在其表面的官能团（—OH、—F、==O、—O等）。有时也直接写作MX，具有MX、MX、MX等六方晶格结构，见图5。由于多层MXenes经超声或者机械剥离后获得的单层MXene 形貌与石墨烯（Graphene）类似，故被命名为MXene。自从2011 年第一种MXene 材料被发现以来，近年来发展迅速，已有超过70 个品种。MXenes 片层的厚度、表面过渡金属和官能团的多样性，赋予了其优异的光、电、磁、电化学性质和亲水性等，可用于光学、半导体、电池、电容器、催化、传感、吸附分离、生物医学等领域。

图5 MAX相及相应的MXenes的框架[55]

MXenes 主要采用刻蚀法制备，包括氢氟酸（HF）刻蚀、改性酸刻蚀、熔融氟盐刻蚀、无氟刻蚀、氯气刻蚀。在制备过程中，根据反应条件的不同，MXenes 片层表面会形成不同的终端官能团。表3 总结了常见的刻蚀方法所采用的试剂、所得材料表面主要的官能团以及各种方法的优缺点。

表3 MXenes的几种刻蚀方法[57,61-67]

HF刻蚀适用范围广，但HF酸性较强，刻蚀过程繁琐且危险，高浓度的HF、较长的刻蚀时间、较高的反应温度都会导致材料表面缺陷，产率降低。相对来说，改性酸法条件更温和一些，包括稀盐酸和单氟化盐溶液、二氟化盐溶液。人们将稀盐酸和LiF、NaF、KF、FeF等氟化盐相结合进行刻蚀，操作安全性得以改善，且制备步骤简便，阳离子插入层间使得制得的MXenes 具有更薄的层片 结 构、更 大 的 层 间 距。NHHF、NaHF、KHF等二氟化盐相较于稀盐酸和单氟化盐组合更安全，制得的MXenes 晶格结构更完整。采用LiF、NaF、KF等熔融氟化盐使MAX高温分解制得MXenes 也是一条途径，优点是可以避免有的MXenes 材料（如TiN）在HF 中溶解，但是这样制得的MXenes的结晶度较差。

以上几种方法都采用含氟化合物，由于这类刻蚀剂具有腐蚀性和毒性，对人体以及环境具有较大危害，因此无氟刻蚀相对更安全、经济。Yang等开发了一种无氟电化学刻蚀方法，以NHCl和四甲基氢氧化铵（TMAOH）为电解质，利用Al与Cl间的强化学键刻蚀掉TiAlC中的Al，NH还可以插入层间，层间距从17Å增至21Å，操作安全，反应温和，但制得的MXenes 为紧密堆积结构，不同于以往的类手风琴状。还可用NaOH 刻蚀，但缺点是TiC骨架也会被腐蚀，这个过程虽然无氟，但是高温高压的反应条件也比较危险，另外，因刻蚀剂中无氟，所以材料表面也无—F 官能团。氯气刻蚀是另一种无氟刻蚀法，但M和A原子有可能会被完全刻蚀掉，生成孔隙丰富的碳化物衍生炭，因此，需要保持合适的反应温度以及刻蚀剂的活性以达到选择性刻蚀以及保持MX层的二维性质的目的。此外，氯气本身是剧毒气体，操作过程也存在危险性。

因层间较强的物理作用力，MXenes 呈层状堆叠态，为获得更好的性能和充分发挥其作为二维材料的优势，人们通常对其进行插层。常见的插层策略有常规法、自上而下、自下而上等（图6）。其中，常规法是指客体仅通过扩散或扩散与离子交换、分子间力、酸碱反应、电化学和氧化还原反应相结合或压力、热和机械诱导等外部因素促进扩散直接嵌入层状主体[图6(a)]；自上而下是指以剥离的二维材料为前体自上而下组装嵌入客体，包括层层自组装、一步共组装[图6(b)]；自下而上是指以分子或离子为前体物自下而上组装嵌入客体，包括原位一锅合成法[图6(c)]。插层剂包括各种离子如Li、Na、K、Ca、Mg、Al、In、HO、Be、NH、H、Cl，有机溶剂如乙醇、二甲基亚砜，聚合物如聚乙烯醇、聚吡咯、超高分子量聚乙烯、聚二甲基硅氧烷等，无机非金属如碳纳米管、还原氧化石墨烯、类石墨相氮化碳，金属氧/硫化物如SbO、CoO、SnO、CdS、MoS等。

图6 MXenes的几种插层策略[68]

阳离子插层采用常规法即可实现。利用MXenes 表面含有负电官能团的特点，插入阳离子后，层间正电荷增多，静电互斥作用增强，层间距增大。在众多阳离子中，插入Al后层间距最大，其次是Be，HO、In、Ca居中，Mg最小，这是因为Al原子半径小，结合水能力较强。同理，Mg比K结合水能力强，因此插入Mg后层间距较大。金属阳离子还可以和水分子结合共同插入层间，进一步增大层间距。有机溶剂与水分子的结合能力较离子弱，因此，插入后的层间距相比离子插层的要小。Lyu 等利用乙醇中的羟基和二甲基亚砜中氧硫键与MXenes 表面的—OH、—F、—O 等形成氢键插入层间，层间距从9.26Å 分别增至10.04Å 和10.16Å，二甲基亚砜的分子量比乙醇大，结构比乙醇复杂，因此导致更大的层间距。MXenes 用不同阳离子以及溶剂插层后的层间距列于表4。

表4 插层前后MXenes的层间距

利用插层剂与MXenes表面的—OH、—F、—O等形成氢键的常规插层策略可以实现聚合物的插层。聚乙烯醇（PVA）中含有大量羟基，可以与—OH、—F、—O 等形成氢键，MXenes 薄膜厚度增大，拉伸强度得到了改善，电容量略微降低。插入聚吡咯（PPy）可使材料导电性能显著提高。Yan 等先用阳离子聚合物聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）修饰还原氧化石墨烯，再通过层层自组装插层，当还原氧化石墨烯质量分数达5%时，MXenes 片层厚度由1.31nm 增至1.50nm。Su 等在稀盐酸水溶液中超声g-CN使其质子化，再利用TiC带负电的特性，通过层层自组装实现了g-CN插层。Li等通过原位一锅合成策略将碳纳米管插入双氢氧化物（LDH）/TiCT层间，用于制备超级电容器。Zhao等通过交替过滤层层沉积实现了碳纳米管插层，MXenes 的电化学性能显著提高。金属氧/硫化物的插层通常采用常规策略。Sb通过离子交换以及与MXenes 表面的负电官能团相互吸引实现预插层，随后在碱性条件下水解得SbO，从而实现SbO插层。在浓NaOH 的条件下，Co与OH反应生成带正电的α-Co(OH)，随后通过静电吸附插入层间，经退火发生氧化还原反应得CoO，达到了CoO插层的目的，MXenes的电磁微波吸收效率显著提高。Ding 等利 用SnO与MXenes 纳米片间形成Sn—O—Ti 键，可以实现SnO插层，显著改善MXenes 的电化学性能。Ran等首先利用Cd与MXenes 表面的—O 静电吸附，再通过S 与Cd配位，实现CdS 插层，可见光催化活性显著提高。也可采用类似方法实现MoS插层，改善MXenes的电化学性能。

总的来说，通过插层可以增大MXenes层间距，弱化层间作用力，防止堆垛，同时改善材料的物理和化学性质。

2.2 MXenes的物理和化学性质

MXenes 优异的物理性质赋予了其良好的光、电等性能。MXenes 材料因其表面官能团不同而功函数不同，在MXenes 表面引入不同的官能团，可以制备性能良好的电子注入器、二极管等电子器件。根据密度泛函理论计算可知，吸附在端氧原子上的氢原子的吉布斯自由能接近0eV，氧/羟基端的氧原子达稳定状态，并且MXenes 为金属材料有利于电荷转移，这使得MXenes 有望成为一种稳定的、高活性的非贵金属催化剂。在朝向真空面的上方区域中，各原子以近乎自由电子状态（NFE）出现，且通常以高于费米能级的能量呈现。NFE态相对于费米能级的位置可通过表面电荷和外加电场来调节，这会产生偶极矩，引发电子转移，赋予其电学特性。MXenes 材料的表面电荷随表面官能团的改变而改变，因此，表面功能化的MXenes可以作为性能优异的半导体。

MXenes 表面丰富的官能团赋予了其优异的化学性质。通常刻蚀掉MAX 中结合力较弱的A 原子后，暴露的M 原子会变得很活泼，很容易结合带负电的氟、氧、氢等配体。因此，MXenes 表面带有丰富的亲水性官能团，如—F、—OH、—COOH、—O、==O等，可以与水分子形成氢键，形成稳定的分散体。除此之外，MXenes 的表面终端官能团还包括—H、—P、—Si、—CHO 等，大多取决于合成条件，如刻蚀和插层条件、M元素的种类组成、后合成和储存条件等。表面官能团会影响MXenes 材料的表面化学性质，例如，与—H 或—OH 封端的MXenes 相比，—O 封端的MXenes 往往具有更大的电池容量。MXenes 在湿度较大的空气中可能会降解。但是，其表面的Ti原子与水或氧反应形成致密的TiO钝化层后，化学性质变得稳定，且阳极极化使这种程度增强。在HF溶液中，Ti原子也会钝化。

2.3 MXenes固定化酶

Mxenes 具有较大的比表面积且表面具有丰富的亲水性官能团，为酶的固定化提供了良好的生物相容性微环境。

与GO 类似的是，MXenes 表面含有丰富的羟基，可以先硅烷化，在载体表面引入氨基，再通过GA固定化酶。Ding等首先用LiF/HCl的混合物刻蚀掉TiAlC中的Al，制得TiCT，再用APTES 改性TiCT，以在纳米片表面引入氨基，然后用GA共价连接CRL（图7），负载率达58.4mg/g。在近红外辐射下，TiCT优异的光热效应使得酶周围局部受热，酶活性增强，连续照射30min，酶比活由无红外辐射时的20.12U/mg 增加到30.18U/mg，提高了近50%。70℃时，固定化脂肪酶的活性为50℃时活性的93%，比游离酶高21%。相同温度和酸碱度下，固定化酶活性比游离酶高。这是由于酶与TiCT之间是通过共价键连接，限制了酶的构象变化，因此酶的稳定性提高。在5次循环利用后，固定化酶仍能保持约初始活性的55%。

图7 固定化脂肪酶的过程及共价固定脂肪酶的机理示意图[90]

利用MXenes 表面带负电的特征可以通过静电作用固定酶。Rozmystowska-Wojciechowskaa 等探究了溶菌酶与MXenes 相互作用时，材料表面化学性质和酸碱度对溶菌酶的影响。该研究用HF 刻蚀TiAlC和TiAlC，制得TiC和TiC，由于起始电位为负，可以吸附带正电荷的溶菌酶分子。其中，TiC比TiC 具有更高的比表面积，值也更高，从而可吸附更多的酶，但在碱性环境下，溶菌酶从MXenes表面释放。

目前，MXenes 固定化酶的一个主要应用是制作电化学传感器。利用其表面的负电性，可通过与壳聚糖溶液混合后滴加到抛光的玻碳电极（GCE）上以形成薄膜，再将酶涂敷到电极表面，制得生物传感器。Zhou等用该法固定了乙酰胆碱酯酶，用于检测马拉硫磷，在pH=8、酶负载量为0.12U、TiCT浓度为0.5mg/mL、抑制时间为10min 时，传感器表现出优异的检测性能，线性范围为1×10～1×10mol/L，检测限为0.3×10mol/L。Ma等先制得G（石墨烯）/TiC/TiC，再将带正电的HRP吸附在G/TiC/TiC上，再与壳聚糖溶液混合后滴加到GCE上（图8）。G/TiC/TiC具有垂直结构，为酶固定提供了较大比表面积；表面含有的—OH、—F基团易与水形成氢键，增强了其亲水性。在pH=6时，因氨基等质子化，酶复合物表现出优异的导电性，该电化学传感器具有较宽的线性范围（5～1650μmol/L），检测限为0.74μmol/L，操作稳定，可用于干贝和牛奶等食物中HO的检测。Wu 等采用类似方法固定酪氨酸酶，制备了可用于检测苯酚的传感器。灵敏度为414.4mA·L/mol，检测限为12nmol/L，线性范围为0.05～15.5μmol/L。

图8 辣根过氧化物酶@MXene/壳聚糖/玻碳电极制备示意图和H2O2传感原理[91]

将MXenes 固定化酶的文献汇总后见表5。可以看出，除了利用材料表面的羟基改性再共价固定之外，更多的是采用静电吸附固定化，目前主要用于传感器。

表5 MXenes固定化酶的文献汇总

3 GO和MXenes的比较

GO 和MXenes 的比较列于表6。GO 由石墨烯经化学氧化再剥离制得，过程中涉及强氧化剂；MXenes主要由MAX经刻蚀制得，需要用到强酸或者强碱。二者的制备过程均存在一定的危险性，且不同的氧化或者刻蚀方法制得的材料在组成、结构、性能等方面存在一定差异。GO 主要由C、H、O等非金属元素组成，以共价键相连接，牢固，酸碱稳定性较好；MXenes 表面含有过渡金属元素，易被氧化致使其结构被破坏，稳定性较差。GO的结构高度无序，具有多种结构模型；MXenes 具有MX、MX、MX等六方晶格结构。二者均具有高比表面积，为酶的固定化提供了较大的空间，但从文献报道的数据来看，MXenes可以获得比GO更高的比表面积，且层间距更大、层数更多。

表6 GO和MXenes的比较

GO 和MXenes 表面官能团略有区别。通常，GO 面内有—OH、环氧基，边缘有—COOH、羰基、酚基、醚键、内酯基、醌基等官能团，其中，可用于固定化酶的官能团主要有—OH和—COOH，其次是环氧基。MXenes 表面有—OH、—F、—COOH、—O、==O、—Cl 等官能团，可用于固定化酶的官能团主要有—OH 和—COOH。相比较而言，GO 表面的可反应官能团种类更多，应用也更为广泛。GO和MXenes的共同点是表面均带有大量负电荷，可以通过静电作用吸附固定带正电荷的酶，且二者表面官能团均可以与水形成氢键，亲水性较好，为酶固定化提供了良好的生物相容性微环境，因此固定化酶活性较高。

通过化学结合法和物理吸附作用，在GO 表面固定的酶有模型酶PersiManXyn1、漆酶、CRL、脂肪酶、天冬氨酸酶、HRP、溶菌酶、OPH 等，催化的反应类型有还原、酯化、水解反应；以MXenes 为载体的酶有CRL、溶菌酶、乙酰胆碱酯酶、HRP、酪氨酸酶等，催化的反应类型有还原和水解反应，更多用来作为生物传感器。此外，MXenes 具有优异的光热效应，可以通过近红外辐射使酶周围局部受热，活性增强。

有意思的是，在单独使用MXene或GO时，层间的π-π作用和范德华力作用致使纳米片间堆叠。但是，两者混合后，排斥作用却会导致产生三维孔道。由于GO 的柔韧性更好，使形成的孔道更丰富；随GO添加量的增大，孔道趋向于无序化，且尺寸变大，酶易扩散进孔道内。Gu等将TiCT与GO的混合液滴加到GCE上成膜，在孔道内固定化GOx，制备了葡萄糖传感器。

4 结语与展望

二维纳米材料具有优异的电学、光学、磁学、力学和化学性能，已广泛应用于电池、超级电容器、储能、催化、吸附分离、传感和生物医学等领域。本文总结并比较了经典二维材料GO和新型二维材料MXenes 的制备方法和结构、物理和化学性质以及它们在固定化酶领域的应用。GO和MXenes具有丰富的表面官能团、良好的亲水性以及生物相容性等特点以及二维材料所特有的高比表面积，为固定化酶提供了优越的条件。由于研究较早以及具有更多的可反应官能团，GO 在固定化酶领域应用更多。MXenes 材料诞生相对较晚，固定化酶的研究还不是很多，然而其在生物传感器方面的应用正受到越来越多的关注，这类材料品种繁多，近年来发展迅速，是非常具有潜力的一种新型材料。通过调节MXenes 片层的厚度、表面过渡金属和官能团的种类以及插层策略，未来在固定化酶领域大有可为。

但是，这两种材料作为二维纳米材料的典型代表，也存在一些问题。首先，材料的制备过程复杂，耗时长，产率较低，且操作过程具有一定危险性；其次，由于层间相对较强的物理作用力，纳米片容易聚集，影响其使用性能；再者，由于回收过程中的损失，固定化酶的循环利用次数大多有限。今后的发展方向还是要开发更为简单易行和安全的材料制备方法，探索更为有效的插层和剥离手段以及改善固定化酶的回收策略，进一步推进二维纳米材料在固定化酶领域的应用。