山楂叶总黄酮对高脂血症肾损伤大鼠的保护作用*

周其其，闵洁，刁婷婷，3，张雨晨，肖峰，要辉，白育庭

(1.湖北科技学院药学院，咸宁 437100；2.湖北省黄石市阳新县人民医院护理部，黄石 435200；3.信阳农林学院生物与制药工程学院，信阳 464000)

近年来，随着社会的发展和生活水平的提高，人们饮食结构发生改变，长期的高脂饮食会诱发心脑血管、内分泌、生殖系统病变等多种疾病。其中，高脂血症是脂质代谢紊乱最典型的表现，由高脂血症及其诱发的其他疾病造成患者死亡人数约占世界疾病死亡人数的一半[1]。高脂血症可诱导单核巨噬细胞在肾脏堆积并抑制细胞外基质蛋白质合成，从而诱发慢性肾损伤，导致肾功能受损[2]，因此，由高脂血症所诱导的肾脏损伤也逐渐受到关注。

山楂叶为蔷薇科植物山里红的干燥叶，其主要成分为山楂叶总黄酮(hawthorn leaves flavonoids，HLF)，包括槲皮素、金丝桃苷、黄酮苷、荭草素、葡荆牡黄酮等多种黄酮类化合物[3]。研究表明，HLF在心脑缺血-再灌注损伤、肝损伤、肾脏损伤等方面均有保护作用，且能降低胆固醇从而调节血脂，而对于高脂血症所引起的肾脏损伤的研究报道较少。故本实验通过建立高脂模型[4]，探讨HLF是否对高脂血症大鼠肾脏具有保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 清洁级SD大鼠48只，雄性，体质量170～200 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司[动物生产许可证号：SCXK(辽)2015-0001；动物使用许可证号：SYXK(鄂)2018-0071]；分笼饲养，昼夜节律12 h，自由饮水摄食，大鼠实验前适应性饲养7 d，室温(22±2) ℃，相对湿度55%～60%。

1.1.2药品与试剂 HLF购自山东临沂爱康药业有限公司(批号：AKH16-3，含量93.5%)。高脂饲料购于北京茆思倍科生物科技有限公司。三酰甘油(TG，批号：20180731)、总胆固醇(TC，批号：20180731)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C，批号：20180816)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C，批号：20180817)、超氧化物歧化酶(SOD，批号：A001-1)、丙二醛(MDA，批号：A003-1)、还原型谷胱甘肽(L-glutathione，GSH，批号：A006-1-1)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px，批号：A005-1)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。兔链霉素卵白素-生物素法检测(兔SP，批号：SP-9001)试剂盒购自中山金桥公司，白细胞介素(IL)-1β(批号：EK301/3-01)、IL-6(批号：EK306/3-01)以及肿瘤坏死因子α(TNF-α，批号：EK382/3-01)购于生物联科公司。二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色液(批号：DA1010)和曲拉通Triton X-100(批号：T8200)购于索莱宝科技有限公司。单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1抗体(bs-1101R)和TGF-β1(bs-0086R)抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。核因子(nuclear factor，NF)-κB P65(#8242)购于Cell Signaling Technology。

1.1.3仪器与设备 电子分析天平(德国Sartorius公司，感量：0.1 mg)；多功能酶标仪(瑞士 Tecan Spark公司)；电脑生物组织脱水机(YAGANG公司)；石蜡包埋机(YAGANG公司)；石蜡切片机(美国Thermo公司)；化学发光成像系统(美国伯乐 Chemi-Doc公司)； 低温高速离心机TGL-20M(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；KZ-II 高速组织研磨仪(武汉塞维尔生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组与造模 SD大鼠 48只，采用随机数字表法平均分为6组，分别为正常对照组，模型对照组，辛伐他汀组，HLF小、中、大剂量组，每组8只，适应性喂养7 d后，正常对照组和模型对照组灌胃0.9%氯化钠溶液1 mL·(100 g)-1·d-1，辛伐他汀组灌胃辛伐他汀8 mg·kg-1·d-1，HLF小、中、大剂量组分别灌胃HLF 100，200，400 mg·kg-1·d-1，连续灌胃给药8周。正常对照组每日饲喂大鼠维持普通饲料，另5组饲喂高脂饮食，饮水摄食自由。大鼠最后一次给药禁食12 h后处死进行取材。

1.2.2生化指标的测定 采用酶标仪测定血浆中的TG、TC、HDL-C和LDL-C等脂质指标的吸光度(A)值[5]。同时，采用同样的方法测定血浆中的SOD、MDA、GSH和GSH-Px等氧化指标的浓度。

1.2.3炎性指标的测定 采用酶联免疫吸附测定实验(ELISA)法测定血浆中的IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量，根据标准曲线计算浓度。

1.2.4苏木精-伊红( HE)染色法观察大鼠肾脏组织的形态 大鼠肾脏组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，经冲洗约1 h以去除表面甲醛后，电脑生物组织脱水机脱水，依次透明、浸蜡，包埋、切片、脱蜡和染色，利用显微镜观察每组大鼠肾组织的病理形态结构变化。

1.2.5马松(Masson)染色法观察大鼠肾脏组织的形态 组织切片脱蜡水化与HE法相同，染色采用试剂盒说明书进行操作，光镜下观察6组大鼠肾组织的纤维化程度。

1.2.6免疫组织化学法检测肾脏组织中MCP-1和TGF-β1蛋白的表达情况 取各组肾脏组织石蜡切片常规脱蜡水化，进行抗原修复15 min，自然状态冷却，加入0.1%Triton X-100室温孵育约40 min，磷酸盐缓冲液(PBS)快速洗3次(每次10 min)，封闭工作液封闭1 h，孵育一抗(1：200)过夜。PBS快速清洗3次，室温孵育二抗1 h，PBS快速清洗3次，加入DAB染色8～10 min后用自来水冲洗数秒终止染色，苏木精复染2 min，盐酸乙醇分化6 s后按照HE法进行封片。光镜下观察各组的各种蛋白表达情况，利用Image profession Plus 6.0版软件进行分析，采用平均A值定量表示MCP-1和TGF-β1的表达量。

1.2.7Western blotting法检测大鼠肾脏组织中NF-κB P65、MCP-1以及TGF-β1蛋白的表达 称取肾脏组织约50 mg，10倍体积的裂解液(RIPA：PMSF：cocktail：矾化钠=100：1：1：1)迅速加入，低温下研磨组织离心后取上清液，采用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)法测定各组蛋白浓度，调整蛋白体积后加入蛋白上样缓冲液，经电泳、转膜、封闭后一抗(1：1000)孵育14 h，与二抗反应后显影，利用Image Lab软件进行灰度值统计。

2 结果

2.1HLF对高脂血症大鼠血浆TG、TC、HDL-C、LDL-C的影响 经前期课题组研究得出，与正常对照组比较，模型对照组TG、TC以及LDL-C明显上升(P<0.01)，说明高脂血症模型已建立成功。与模型对照组比较，辛伐他汀组与HLF给药组TG、TC以及LDL-C明显降低(P<0.05)，且与剂量呈正相关[5]。

2.2HLF对高脂血症大鼠血浆中IL-1β、IL-6以及TNF-α的影响 与正常对照组比较，模型对照组IL-1β、IL-6以及TNF-α含量明显增加(P<0.05)；与模型对照组比较，辛伐他汀组中IL-1β与TNF-α含量明显降低(P<0.05)；HLF给药组IL-1β、IL-6以及TNF-α均明显降低(均P<0.05)，且与剂量相关，结果见表1。

表1 6组大鼠血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量比较Tab.1 Comparison of plasma levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α among six groups of rats pg·mL-1，±s，n=6

2.3HLF 对高脂血症大鼠血浆中SOD、MDA、GSH以及GSH-Px的影响 与正常对照组比较，模型对照组SOD明显降低(P<0.05)，MDA明显增加(P<0.05)，GSH活力与GSH-Px活力明显降低(P<0.05)；与模型对照组比较，辛伐他汀组SOD的含量明显增加(P<0.05)，MDA的含量明显降低(P<0.05)，GSH-Px活力明显增加(P<0.05)；HLF大剂量组SOD明显增加(P<0.05)，MDA明显降低(P<0.05)，GSH与GSH-Px活力明显增加(P<0.05)，结果见表2。

表2 6组大鼠血浆中SOD、MDA、GSH及GSH-Px的含量比较 Tab.2 Comparison of plasma contents of SOD，MDA，GSH and GSH-Px among six groups of rats ±s，n=8

2.4HLF对高脂血症大鼠肾脏组织的形态结构的影响 正常对照组肾脏组织的肾小球完整，无明显损伤；模型对照组大鼠肾脏组织中肾小球结构紊乱，体积增大，单核细胞浸润明显，系膜区增宽，基质增厚，肾小球毛细血管出现分叶状。与模型对照组比较，辛伐他汀组与HLF给药组肾小球结构有所改善，结果见图1。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.辛伐他汀组；D.HLF小剂量组(100 mg·kg-1)；E.HLF中剂量组(200 mg·kg-1)；F.HLF大剂量组(400 mg·kg-1)。图1 6组大鼠肾脏组织的形态结构 (HE，×400) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).Fig.1 Morphological structure of kidney tissues in six groups of rats(HE，×400)

2.5HLF对高脂血症大鼠肾脏组织的纤维化的影响 与正常对照组比较，模型对照组肾小球内及肾间质有较多的胶原纤维沉积，辛伐他汀组与HLF中、大剂量组纤维化程度明显降低，HLF小剂量组纤维化降低程度不明显，结果见图2。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.辛伐他汀组；D.HLF小剂量组(100 mg·kg-1)；E.HLF中剂量组(200 mg·kg-1)；F.HLF大剂量组(400 mg·kg-1)。图2 6组大鼠肾脏组织的纤维化程度(Masson，×400) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).Fig.2 Fibrosis degree of kidney tissues in six groups of rats (Masson，×400)

2.6HLF对高脂血症大鼠肾脏组织中MCP-1和TGF-β1蛋白表达的影响(免疫组织化学检测) 结果表明，MCP-1与TGF-β1在肾小管和集合管中呈现较多，肾小球中较少。模型对照组与正常对照组比较，棕色明显加深，辛伐他汀组与HLF小剂量组颜色较模型对照组颜色稍浅，HLF中、大剂量组颜色明显减弱，且采用Image Pro Plus 6.0版软件定量分析后得出与观察的结果相符合，结果见图3～5。

A．正常对照组; B．模型对照组; C．辛伐他汀组; D．HLF 小剂量组( 100 mg·kg-1);E．HLF 中剂量组( 200 mg·kg-1) ; F．HLF 大剂量组( 400 mg·kg-1) 。图3 6组大鼠肾脏组织中MCP-1 蛋白的表达(×400)A．normal control group; B．model control group; C．simvastatin group; D．HLF low dose group ( 100 mg·kg-1) ; E．HLF medium dose group(200 mg·kg-1) ; F．HLF high dose group ( 400 mg·kg-1) ．Fig．3 Expression of MCP-1 protein in kidney tissues of six groups of rats(×400)

A.正常对照组；B.模型对照组；C.辛伐他汀组；D.HLF小剂量组(100 mg·kg-1)；E.HLF中剂量组(200 mg·kg-1)；F.HLF大剂量组(400 mg·kg-1)。图4 6组大鼠肾脏组织中TGF-β1蛋白的表达(×400) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).Fig.4 TGF-β1 protein expression in kidney tissues of six groups of rats (×400)

A.正常对照组；B.模型对照组；C.辛伐他汀组；D.HLF小剂量组(100 mg·kg-1)；E.HLF中剂量组(200 mg·kg-1)；F.HLF大剂量组(400 mg·kg-1)。①与正常对照组比较，t=11.938，11.423，P<0.05；②与模型对照组比较，t=-9.635～-2.544，P<0.05；③与辛伐他汀组比较，t=-2.203～-2.110，P<0.05；④与HLF小剂量组比较，t=-2.518，-3.982，P<0.05。图5 6组大鼠肾脏组织中MCP-1和TGF-β1蛋白表达的比较±s，n=5) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).① Compared with normal control group，t = 11.938，11.423，P<0.05；②Compared with model control group，t=-9.635--2.544，P<0.05；③ Compared with simvastatin group，t=-2.203--2.110，P<0.05；④Compared with HLF low dose group，t=-2.518，-3.982，P<0.05.Fig.5 Comparison of MCP-1 and TGF-β1 protein expression in kidney tissues among six groups of ±s，n=5)

2.7HLF对高脂血症大鼠肾脏组织中NF-κB P65、MCP-1以及TGF-β1蛋白表达的影响(Western blotting法检测) 模型对照组与正常对照组比较，NF-κB P65、MCP-1与TGF-β1表达明显增加(P<0.05)，辛伐他汀组与HLF组较模型对照组蛋白表达均有所降低，且与剂量呈相关性。结果见图6。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.辛伐他汀组；D.HLF小剂量组(100 mg·kg-1)；E.HLF中剂量组(200 mg·kg-1)；F.HLF大剂量组(400 mg·kg-1)。①与正常对照组比较，t=4.468～5.542，P<0.05；②与模型对照组比较，t=-5.476～-2.219，P<0.05；③与HLF小剂量组比较，t=-2.498，-2.696，P<0.05。图6 6组大鼠肾脏组织中NF-κB P65、MCP-1及TGF-β 1蛋白表达的比较±s，n=4) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).① Compared with normal control group，t=4.468-5.542，P<0.05；② Compared with model control group，t=-5.476--2.219，P<0.05；③ Compared with HLF low dose group，t=-2.498，-2.696，P<0.05.Fig.6 Comparison of the expression of NF-κB P65，MCP-1 and TGF-β1 in kidney tissues among six groups of ±s，n=4)

3 讨论

长期高脂饮食会导致脂质代谢紊乱，进一步引起肾脏结构改变与功能损伤，包括肾小球肥大，基底膜、系膜基质扩张和肾脏炎症发生，这些改变可导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化[6]。本实验模型对照组大鼠血浆中的TG、TC、LDL-C明显增加，说明成功建立了高脂血症模型[7]，HE染色结果显示模型对照组大鼠肾脏组织中肾小球增大，单核细胞浸润，基质增厚，肾小球出现肉眼可见的纤维化，说明高脂血症能对大鼠肾脏组织造成损伤。

高脂血症与氧化应激密切相关，当机体脂质代谢紊乱时使得体内活性氧的产生和清除失衡，产生过多的氧自由基。SOD和GSH-Px属于酶抗氧化系统，其含量降低表明机体受到氧化应激反应。本实验结果表明，模型对照组血浆中SOD和GSH-Px含量明显降低，而给予不同剂量HLF后SOD和GSH-Px含量较模型对照组增加，表明HLF具有一定的抗氧化作用。MDA属于非酶系统产生氧自由基，MDA过多会引发脂质过氧化作用，因此可以反映机体内脂质过氧化的程度，从而间接反映机体受自由基攻击的严重程度。本研究表明，模型对照组中MDA含量明显升高，给予HLF不同剂量后MDA含量有所降低，说明HLF可能具有保护细胞的作用。基于以上实验结果可说明HLF保护肾损伤可能与其抗氧化有关，但具体的机制还需进一步探讨。

血脂异常可促进肾脏疾病的进展，而炎症是高脂血症引起肾脏疾病的重要因素之一，其病变机制可能与脂质蓄积引起脂质代谢紊乱有关，脂质可作为炎症的介导[8]，其中IL-1β、IL-6和TNF-α是最主要的促炎因子[9]。本实验给予不同剂量HLF，可有效降低高脂饮食大鼠TG、TC和LDL-C，且能降低IL-1β、IL-6和TNF-α表达，说明HLF能降低血脂且具有一定的抗炎作用。肾纤维化是由多个炎症细胞和细胞因子信号传导途径相互作用的结果，其中关键的纤维化因子包括MCP-1、TGF-β1、NF-κB和TNF-α[10]。NF-κB被认为是与炎症相关的主要信号通路，可调控MCP-1和TGF-β1[11]。MCP-1是一种单核细胞趋化因子，高脂饮食导致的肾脏损伤时肾脏组织中MCP-1与TGF-β1mRNA表达增高，MCP-1及其趋化受体因子受体2(chemokine receptor 2，CCR2)因其在介导慢性肾脏疾病中具有重要的作用而得到了广泛认可[12]。TGF-β1是TGF-β的最主要亚型，在肾纤维化中是重要的炎症/细胞驱动因子，在许多疾病模型中，可以通过抑制TGF-β1/Smad信号传导而减轻肾损伤和纤维化[13]。本研究发现，高脂血症大鼠肾脏组织中出现明显的纤维化，且其MCP-1、TGF-β1和NF-κB的表达均有所增加，说明高脂血症可能会促进肾脏的纤维化。不同剂量HLF均可以降低MCP-1、TGF-β1和NF-κB的表达，减轻肾脏的纤维化，其作用机制与炎症有关，但具体机制有待进一步研究。

目前，调血脂药物主要以辛伐他汀为主，其用途较广，但不良反应较严重，且耐受性较差，因此，研发更安全有效的调血脂药物具有重要的意义。HLF作为山楂叶主要活性成分之一，低毒安全，药理作用广泛，对糖尿病肾病和肾缺血-再灌注损伤等具有良好的保护作用[3]，其机制可能是通过调控糖尿病肾病肾组织p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号转导通路从而改善氧化应激对肾组织的损伤发挥作用[14]。本研究显示，HLF能有效降低高脂饮食大鼠的血脂，且降低机体的氧化应激水平，减少炎症因子的释放，这可能与HLF抑制NF-κB P65、MCP-1以及TGF-β1在肾脏中的表达有关，与相关研究结果相符[15]。

综上所述，长期高脂饮食会导致大鼠的血脂升高，肾脏组织损伤，出现肾脏纤维化；HLF通过其抗氧化功能和炎症调节作用以调控MCP-1与TGF-β1信号通路，从而缓解肾组织损伤，减轻肾脏的纤维化。深入研究HLF对高脂饮食人群肾脏的保护作用将为临床防治肾脏损伤提供新的解决思路。