三七姜高效液相色谱指纹图谱建立及3种成分含量测定*

梁洁，祁金丽，杨川川，胡珏，陈辉华，曹玉嫔，李耀华，孙正伊

(1.广西中医药大学药学院，南宁 530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200；3.广西优势中成药与民族药开发工程技术研究中心，南宁 530200；4.广西中医药大学附属瑞康医院药学部，南宁 530011)

广西壮族自治区民间传统的壮药三七姜，收载于《广西壮族自治区壮药质量标准》(第二卷)，为姜科(Zingiberaeeae)姜七属植物土田七Stahlianthusinvolucratus(King ex Bak.) Craib.的块根和根茎，又称土田七、小田七、竹田七、毛七、姜三七等，分布于广西、云南、广东、福建等省区[1-2]。其性温、味辛，具有散瘀、止痛、止血等功效，主要化学成分是挥发油，以块根入药，三七姜对跌打损伤、消肿止痛有明显的疗效，史书明确记载该药材可散瘀消肿、活血止血、行气止痛、跌打损伤等[3]。现代药理研究表明，三七姜对雌、孕激素负荷大鼠子宫肌瘤、子宫肌瘤患者血清中Bcl-2有一定的抑制作用[4-5]，诱导人鼻咽癌CNE-2细胞G1期阻滞、抑制细胞增殖[6]，有一定抗炎作用[7]。三七姜的化学成分有挥发油、黄酮类、皂苷、酚类、蒽醌类、植物甾醇、三萜、氨基酸、糖类和有机酸等[8-11]。文献仅报道气相色谱法建立三七姜挥发油指纹图谱，笔者尚未见三七姜原儿茶酸、对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛含量测定及指纹图谱相关研究报道。中药质量标志物(Q-Marker)是刘昌孝等[12]首次提出的从有效性、可测性等方面把控中药质量的新概念，药效(功效) 是反映中药有效性的本质特征，原儿茶酸具有降血压、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等功效[13]；对羟基苯甲酸具有抗炎和神经保护的药效[14]；对羟基苯甲醛具有抗血小板聚集、减轻神经炎症损伤等生物活性[15]。

遵循质量标志物的原则，以上3种成分均与三七姜功效相关，将其确定为含测指标科学而合理。笔者选择三七姜中原儿茶酸、对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛为指标，研究其含量测定方法和指纹图谱，为三七姜药材的质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Millipore Simplicity-185超纯水仪(美国密里博公司)；CPA225D型分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司，感量：0.01 mg)；FW-100高速万能粉碎机(北京永光明医疗仪器有限公司)； TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)； RE-2000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2试药 对照品原儿茶酸(批号：RP190605)、对羟基苯甲酸(批号：RP190609)、对羟基苯甲醛(批号：RP180913)、莪术二酮(批号：RP190405)，均由成都麦德生科技有限公司提供，对照品含量均>98.0%。甲醇、乙腈(美国 Fisher 公司，色谱纯)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。10批药材经广西中医药大学滕建北教授鉴定为姜科(Zingiberaeeae)姜七属植物土田七Stahlianthusinvolucratus(King ex Bak.) Craib.的块根和根茎。将药材样品粉碎，10批样品的信息见表1。

表1 三七姜药材样品信息 Tab.1 Sample information of Stahlianthus involucratus

2 方法与结果

2.1供试品溶液的制备 称取不同产地三七姜粗粉适量，加入8倍体积量的80%乙醇，加热回流提取3次(每次2 h)，滤过并收集滤液，合并滤液，减压浓缩，得到三七姜提取物。取三七姜提取物0.1 g，精密称定，置10 mL量瓶中，用甲醇5 mL超声提取5 min，加甲醇定容，过滤，滤液13 000 r·min-1离心10 min(r=15.7 cm)，取上清液过孔径0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2对照品溶液的制备 取莪术二酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含莪术二酮0.2 mg的对照品溶液备用。另取原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含原儿茶酸0.023 6 mg、对羟基苯甲酸0.021 2 mg、对羟基苯甲醛0.014 9 mg的混合对照品溶液备用。

2.3高效液相色谱(HPLC)指纹图谱建立

2.3.1色谱条件 Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长为220 nm，柱温35 ℃，进样量15 μL。以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)为流动相进行梯度洗脱(0～10 min，30%～50%A；10～40 min，50%～75%A；40～60 min，75%～95%A；60～70 min，95%～100%A)，流速0.8 mL·min-1。

2.3.2精密度实验 取三七姜(S1)适量，按上法制备供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，以4号峰(莪术二酮)为参照峰，记录HPLC图，结果各色谱峰相对保留时间RSD 0.06%～0.14%，相对峰面积的RSD 0.59%～1.94%，表明仪器的精密度良好。

2.3.3稳定性实验 取三七姜(S1)供试品溶液，按上述的色谱条件分别在0，2，4，8，16，24 h进行检测，考察样品溶液的稳定性。结果，各色谱峰相对保留时间的RSD0.15%～0.34%，相对峰面积的RSD1.53%～2.91%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.4重复性实验 取三七姜(S1)适量，平行制备供试品溶液6份，依法进样测定，记录 HPLC 图，考察实验方法的重复性。结果，各色谱峰相对保留时间的RSD0.15%～0.36%，相对峰面积的RSD 1.33%～2.61%，表明本方法重复性良好。

2.3.5指纹图谱建立 分别取三七姜药材10批，按“2.1”项方法制备供试品溶液， 在“2.3”项色谱条件进样15 μL测定，所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.1版)，采用中位数法，时间宽度0.1 min，自动匹配生成10批三七姜药材的指纹图谱和对照图谱 (图1)。

图1 10批不同产地三七姜药材指纹图谱 Fig.1 Fingerprints of ten batches of Stahlianthus involucratus from different origins

2.3.6色谱峰归属 通过自动匹配，系统依据三七姜药材的共有模式， 生成对照指纹图谱， 确定了16个共有峰，作为三七姜药材特征峰。其中4号峰(莪术二酮)稳定性好，色谱响应值较高，保留时间较为适中，故选择4号峰(莪术二酮)作为参照峰。

2.3.7相似度分析 本实验借助国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版》软件，对10批三七姜药材的指纹图谱进行相似度计算，相似度分别为：0.988，0.979，0.987，0.989，0.993，0.973，0.994，0.989，0.929，0.990。表明该药材各批次间共有成分基本一致，但批次间各成分含有量存在一定差异。

2.3.8聚类分析 运用聚类分析对三七姜药材的指纹图谱进行分析，将10批样品的共有峰峰面积为变量，运用SPSS 21.0版软件对10批三七姜药材进行聚类分析，采用组间平均数联结法，以欧氏距离(Euclidean distance)作为样品的度量标准，对10批三七姜药材的指纹图谱数据进行分析，结果见图2。结果发现当欧氏距离为15时，10批三七姜药材大致分为三类：第一类：S1、S3、S4、S5、S7、S8、S10，第二类：S2、S6，第三类：S9。

图2 10批三七姜药材的聚类分析 Fig.2 Cluster analysis of ten batches of Stahlianthus involucratus

2.3.9主成分分析 将三七姜样品S1～S10 的共有峰峰面积导入SPSS 21.0版软件进行主成分分析，从16个变量中共提取3个主成分，累计方差贡献率达93.875%，其中第一主成分方差贡献率为59.016%，第二主成分方差贡献率为24.307%，第三主成分方差贡献率为10.552%，能比较全面地反映样品的信息。因此，以第一、二、三主成分的空间散点坐标系建立3D分布图，得到10批样品的主成分分析空间得分图，见图3。结果发现，可将10批不同产地的三七姜药材大致分为三类：其中S9为第一大类、S2、S6为第二大类、S1、S3、S4、S5、S7、S8、S10为第三大类。其结果与聚类分析结果一致。

图3 10批三七姜药材的PCA得分散点图 Fig.3 PCA score scatter plot of ten batches of Stahlianthus involucratus

2.4原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛含量测定

2.4.1色谱条件 Syncronis C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长为260 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)为流动相进行梯度洗脱(0～10 min，15%～18%A；10～15 min，18%A；15～20 min，18%～20%A)，流速0.8 mL·min-1。

2.4.2专属性实验 精密吸取混合对照品溶液和三七姜供试品溶液(S1)，按照“2.4.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图，结果见图4，三七姜供试品溶液与混合对照品中的原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛相对保留时间基本相同，供试品溶液色谱图中，原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛与相邻峰分离度>1.5，符合要求，说明该法具有良好的专属性。

1.原儿茶酸；2.对羟基苯甲酸；3.对羟基苯甲醛。图4 三七姜样品和混合对照品HPLC图谱 1.protocatechuic acid；2.p-hydroxybenzoic acid；3.p-hydroxybenzaldehyde.Fig.4 HPLC chromatograms of Stahlianthus involucratus sample and mixed reference substances

2.4.3线性关系考察 精密吸取“2.2”项下的对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.7 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶液制成一系列浓度的对照品溶液，依法进样测定，记录3种成分的峰面积，以质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行回归，绘制标准工作曲线。得到原儿茶酸的标准曲线为Y=35 348.317 1X+0.913 4，r=0.999 91(n=6)，在2.36～16.52 μg·mL-1内线性范围良好；对羟基苯甲酸的标准曲线为Y=59 585.950 2X-0.624 4，r=0.999 97(n=6)，在2.12～14.84 μg·mL-1的线性关系良好；对羟基苯甲醛的标准曲线为Y=38 373.962 3X-0.59，r=0.999 98(n=6)；在1.49～10.43 μg·mL-1的线性关系良好。

2.4.4精密度考察 按“2.2”项下的混合对照品溶液，按“2.4.1”项下的色谱条件，连续进样6次，测定其峰面积，测得原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛峰面积的RSD值分别为0.30%，0.35%，0.57%，表明仪器精密度良好。

2.4.5稳定性考察 取同一批供试品溶液(S1)，按“2.4.1”项下色谱条件，分别于0，4，8，12，16，24 h测定，记录色谱图，测得原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的峰面积RSD分别为1.49%，1.56%，1.50%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.6重复性考察 用同一产地三七姜药材(S1)6份，按“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下的色谱条件测定，记录原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的峰面积，计算各成分含量，结果3种成分含量的RSD分别为0.77%，1.11%，1.01%，表明该方法重复性良好。

2.4.7加样回收实验 精密称取已知含量的三七姜药材(S1)6份，每份0.05 g，精密称定，分别精密加入“2.2”项下的混合对照品溶液适量，按照“2.1”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.4.1”项下的色谱条件测定峰面积，计算供试品中原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的平均回收率分别为101.50%，101.54%，100.67%，RSD分别为1.85%，1.81%，1.54%，结果见表2。

表2 供试品中3种成分加样回收率实验结果 Tab.2 Recovery rate experimental results of three components in the test sample n=6

2.5样品含量测定 取不同产地的三七姜样品10个批次，每个批次平行制备供试品溶液3份，依法进样测定，记录原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛3种成分的峰面积，并计算各成分的含量(表3)。

表3 不同产地的三七姜含量测定结果 Tab.3 Content determination results of Stahlianthus involucratus from different origins mg·g-1，n=3

3 讨论

指纹图谱研究中，分别比较COSMOSIL 5 C18-PAQ(4.6 mm×250 mm，5 μm)、依利特ODS-2 HYPERSIL(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Phenomenex Kinetex XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)3种色谱柱，Phenomenex Kinetex XB-C18对各成分的分离效果及峰型较好，基线较平，保留时间适当，故选择该色谱柱。分别对甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%冰醋酸不同的流动相系统进行了考察，结果显示乙腈-0.1%磷酸的分离度较好。分别考察了220，256，280，300，340 nm 5个波长的色谱图，结果表明，在220 nm处显示较多的峰信息，各峰型较好、基线平稳，因此选择220 nm作为检测波长。分别考察了20，25，30，35 ℃不同柱温下的色谱图，结果表明柱温在35 ℃时，各峰分离效果较好。考察了0.8，1.0，1.2 mL·min-1不同流速下的色谱图。结果表明流速在0.8 mL·min-1时，各峰分离效果较好。分别对5，10，15 μL不同进样量进行了考察，结果表明，15 μL的图谱峰面积较适合，故采用15 μL作为进样量。

含量测定结果可知10个产地的三七姜的药材均含有原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛这3种成分，但不同产地的三七姜药材中原儿茶酸、对羟基苯甲酸以及对羟基苯甲醛的含量存在差异，其中产地S8中原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛含量较高，而产地S2含量较低。推测造成这样差异的原因可能与药材生长的环境、气候、采收季节等因素有关。指纹图谱研究表明10批三七姜相似度>0.9，均符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》规定。运用SPSS21.0版软件对10批不同产地三七姜提取物指纹图谱进行聚类分析和主成分分析，结果得到聚类分析和主成分分析结果相一致。药材中的某些元素及含量与生长地经纬度、海拔以及土壤密切相关[16]。本文三七姜第一类S2、S6的经度分别为110°28′E，110°14′E，这2个产地经度相近可将其归为一类；第二类S9经纬度为107°37′E，22°42′N该产地与其他9个产地的经纬度相差较远故归为一类；第三类S1、S3、S4、S5、S7、S8、S10的纬度分布在22°84′N～24°70′N之间，这7个产地之间的纬度相近可将其归为一类，10批不同产地三七姜分为三类，存在差异的原因推测可能受地理因素经纬度的影响，更多的影响因素及全国其他地区的药材有待进一步广泛的收集与研究，确保其建立指纹图谱的广泛性和特征性，为其今后深入地研究与开发利用提供有力的科学支撑。本实验采用 HPLC 法研究三七姜指纹图谱和含量测定方法，可为三七姜质量控制提供参考。