高效分子排阻色谱-多角度激光光散射法测定人凝血因子Ⅷ产品分子量及其分布

王皓南，王文晞，郭江红，姜红，

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.湖北省药品监督检验研究院，武汉 430075)

人凝血因子Ⅷ(human coagulation factor Ⅷ，F-Ⅷ)是人体内源性凝血途径的主要成分。血液中F-Ⅷ缺乏会导致不同程度的凝血功能障碍，即甲型血友病[1]。F-Ⅷ是所有血浆凝血因子中含量最低者，血浆内含量为0.1 mg·L-1，等电点约为4.3，以单链形式合成[2-3]。由于蛋白质结构复杂且分子量大，致使 F-Ⅷ很不稳定，在原料血浆收集以及提取制备过程中容易降解失活。不同企业采用工艺不同，F-Ⅷ提取纯化工艺、药品的包装储存以及输液方式也可影响其凝血活性，致使人凝血因子Ⅷ产品间的质量可能存在差异。

分子量是蛋白质的最基本性质，是蛋白质分析鉴定的重要依据。因此，测定分子量及其分布对于F-Ⅷ产品的质量控制和质量评价有重要意义。多角度激光光散射仪能够测定生物大分子的绝对分子量[4-7]，同时，无需标准物质校正，并获得样品分子量分布和样品构象信息。笔者未见用此项技术测定F-Ⅷ分子量及其分布的相关文献报道。本文以不同企业(A、B、C)的F-Ⅷ产品为研究对象，建立了高效分子排阻色谱-多角度激光光散射法(high performance molecular exclusion chromatography-multi angle laser light scatter，HPSEC -MALLS)测定F-Ⅷ产品分子量及其分布的方法，并对不同企业产品的测定结果进行比较。

1 材料与方法

1.1仪器 Waters e2695-2414液相系统(沃特世科技有限公司)，Wyatt Heleos Ⅱ多角度激光光散射检测器(美国怀雅特技术公司)，AUW220D 电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司，感量：0.1 mg)，TSK gel G3000SWXL(7.8 mm×300mm，5 μm)凝胶柱(日本东曹株式会社)，Waters2414 示差折光检测器(沃特世科技有限公司)，Astra软件。

1.2试药 血清白蛋白(中国食品药品检定研究院，批号：140619-201723，每支21.8 mg)；F-Ⅷ(企业A，规格：每瓶200 U，批号：20190825，20190826，20190932，20190934，20200308；企业B，规格：每瓶300 U，批号：20190402，20190507，20190608，20190609，20190713；企业C，规格：每瓶200 U，批号：20201102，20210103，20210402。共13批)；二水磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)、异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)，其他试剂均为色谱纯，水为超纯水。

1.3色谱条件 流动相：0.5 mol·L-1NaH2PO4·2H2O 200 mL，0.5 mol·L-1Na2HPO4.2H2O 420 mL，异丙醇15.5 mL，超纯水914.5 mL(混匀后用孔径0.45 μm水溶性膜滤过并超声脱气)；流速：0.6 mL· min-1，进样量20 μL，柱温30 ℃，示差温度：30 ℃，dn/dc值：0.185[8]。

1.4对照品溶液的制备 将血清白蛋白用流动相稀释成每毫升含蛋白质约12 mg的溶液。

1.5供试品溶液的制备 取F-Ⅷ样品适量，精密加入注射用水1 mL，混匀，供试品溶液浓度为2.8～6.0 mg·mL-1。4 ℃静置过夜，注入液相色谱-多角度激光光散射检测仪测定分子量。

2 结果

2.1准确度实验和精密度实验 取血清白蛋白对照品溶液，按“1.3”项色谱条件连续进样6次，每次进样 20 μL。按上述条件测定，Astra软件自动计算分子量，供试品的分子量为6.588×104(n=6)。人血白蛋白的分子量6.646×104，所测结果与实际值差异较小，为0.87%，表明准确度好。6次人血白蛋白对照品溶液分子量测定结果RSD值为2.26%，表明精密度良好。

2.2重复性实验 取一批企业A产品(批号：20200308)，按上述方法操作，重复6次。6次的4个峰保留时间分别约为10.6，11.5，13.2，14.3 min，计算其RSD值依次为0.810%，1.147%，0.876%，0.668%。4个组分对应分子量RSD值依次为0.687%，1.579%，1.790%，1.781%，表明该方法的重复性良好[9]。

2.3人凝血因子Ⅷ的分子量及其分布测定 取“1.5”项下方法制备供试品溶液，进样测定，获取色谱图，并通过 Astra软件进行数据处理。样品分子典型图谱见图1，结果显示，在溶液状态(自然状态)下，3家企业的人凝血因子Ⅷ产品均由4个组分组成，按照分子从大到小，命名为组分1，2，3，4，其对应的分子量分别约为7.831×106(±3.301%)、5.283×105(±2.393%)、2.544×105(±1.671%)、2.023×105(±2.534%)，对应保留时间依次约为10.6，11.5，13.2，14.3 min。此外，不同企业的4个组分含量不一致，其对应组分平均值依次为企业A：25.3%，22.4%，27.8%，24.6%；企业B：23.9%，30.1%，24.9%，21.1%；企业C：23.4%，35.7%，25.2%，15.8%，各组分占比信息详情可见表1。F-Ⅷ的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)及分布系数(Mw/Mn)等分子量及其分布信息结果见表2。

A、B、C分别为企业A、企业B和企业C的人凝血因子Ⅷ的色谱图；1，2，3，4分别为人凝血因子Ⅷ的组分1、组分2、组分3和组分4。图1 不同企业人凝血因子Ⅷ的典型HPSEC -MALLS图A，B，and C are chromatograms of F-Ⅷ from enterprise A, B and C, respectively；1，2，3 and 4 are component 1，component 2，component 3 and component 4 of F-Ⅷ，respectively.Fig.1 Typical HPSEC -MALLS diagram of F-Ⅷ products from different enterprises

表1 不同企业生产的F-Ⅷ的组分占比 Tab.1 Proportion of each component in F-Ⅷ produced by different enterprises %

表2 不同企业F-Ⅷ中各组分的分子量及分布信息 Tab.2 Molecular weight and distribution information of each component in F-Ⅷ from different enterprises

续表2 不同企业F-Ⅷ中各组分的分子量及分布信息 Tab.2 Molecular weight and distribution information of each component in F-Ⅷ from different enterprises

3 讨论

3.1样品浓度的选择 多角度激光光散射的散射光色谱信号激光信号强度和示差折光检测器信号RI可以直接计算色谱信号上每一点的分子量[9]。一般情况下，最佳进样浓度是为了保证进样的蛋白质含量不会超出凝胶色谱柱的负荷。本实验样品溶液的浓度(2.8～6.0 mg·mL-1)进入系统，经强度正比于分子量、浓度、折光指数增量(dn/dc)的平方以及角度函数P(theta)。HPSEC -MALLS中得到的过凝胶色谱柱分离，色谱图上每一点(组分)满足稀溶液需求，因此，浓度效应可以忽略。此外，黏度与流动相几乎无差异(稀溶液)。样品测试前，系统使用血清白蛋白作为对照品，其结果符合±5%测试误差需求，系统性能正常，以保证测定结果的准确性。

3.2流动相选择 分子排阻法使用的流动相通常为水溶液或缓冲溶液[10]，溶液的pH值一般为2～8。根据F-Ⅷ的溶解性及主要成分为蛋白类组分，本次考察了pH值6.86磷酸盐缓冲液、0.7% 硫酸钠溶液、0.9%氯化钠溶液、纯化水为流动相，分离效果均一般。最终选择《中华人民共和国药典》2020 年版通则3121“人血白蛋白多聚体测定法”中的流动相进行实验[11]，结果表明，以0.5 mol·L-1NaH2PO4·2H2O 200 mL、0.5 mol·L-1Na2HPO4·2H2O 420 mL、异丙醇15.5 mL、超纯水914.5 mL为流动相，供试品中各组分色谱分离图效果较好。

3.3色谱柱考察 考察了TSK GEL G2000 SWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)、TSK GEL G3000 SWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)、 TSK GEL G3000 SW(600 mm×7.5 mm，10 μm)、TSK GEL G4000 SWXL(7.8 mm×300 mm，8 μm)等4种规格的色谱柱对产品溶液分离度的影响。结果表明，采用TSK GEL G3000 SWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)色谱柱时，供试品中各组分色谱图分离效果较好。因此，本研究选取 TSK GEL G3000 SWXL色谱柱测定F-Ⅷ分子量及其分布。

3.4F-Ⅷ组分分析 血浆来源的F-Ⅷ产品由两部分组成，即F-Ⅷ和人血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)[1，3]。F-Ⅷ与vWF在血浆中形成复合物，vWF是作为F-Ⅷ的载体蛋白在凝血过程中发挥稳定F-Ⅷ作用。F-Ⅷ的分子量约为3.0×105，vWF分子量约为2.2×105[1，12]。大部分F-Ⅷ易被蛋白酶裂解，形成两条单链，即一条轻链(A3-C1-C2)和一条重链(A1-A2和长度不定的B区组成)，重链分子量约2.0×105，轻链分子量约8×104[2-3]。对产品各蛋白质组分进行初步推测结果为：①组分1为F-Ⅷ和vWF形成的复合物的多聚体；②组分2可能为F-Ⅷ与vWF形成的复合物单体；③组分3为F-Ⅷ重链；④组分4为F-Ⅷ轻链的寡聚物。

3.5不同企业间产品的差异分析 F-Ⅷ-vWF复合物多聚物由于活性位点被掩盖，失去了凝血活性，F-Ⅷ的重链和轻链容易降解，因此，F-Ⅷ-vWF复合物单体是人凝血因子Ⅷ的主要活性成分[2]。本研究对不同的蛋白质组分含量进行了测定，3家生产企业的各蛋白质组分占比主要体现在活性成分组分2(F-Ⅷ-vWF)的差异。3家企业产品的比活性结果显示：企业C最高，为约100 U·mg-1蛋白质；企业B为约60 U·mg-1；企业A最低，为约40 U·mg-1。这与组分2占比差异一致，提示组分2的含量与临床有效性正相关。

3家企业组分1含量无显著差异。组分2差异的原因是F-Ⅷ降解产物组分3和组分4的差异，即产品越稳定，其活性也越高。将不同企业的处方工艺与组分结果进行比对分析，初步推断出影响产品稳定性的原因：①S/D灭活时间较长可能会加速F-Ⅷ的降解，企业A灭活时间最长，其组分2含量也最低；②在产品质添加适量的蛋白质稳定剂，如聚山梨酯80，能提高溶液稳定性，企业B的处方中添加了聚山梨酯80，其组分2含量也较高；③该品种为冻干制品，冻干过程中添加的较多的甘氨酸保护剂能提高产品稳定性，企业C甘氨酸添加量为12 g·L-1，而企业A、B均为7 g·L-1。

综上所述，本文建立的方法可用于F-Ⅷ分子量及其分布的测定，并能对不同企业的产品进行区分，为产品的质量评价提供技术支持。不同企业的F-Ⅷ产品均由4个组分组成，企业间产品的差异体现在组分2含量不同。通过对不同企业处方及工艺的比较分析，病毒灭活时间和稳定剂的选择会影响产品组分2的含量。本文建立的方法可用于F-Ⅷ分子量及其分布的测定，并能对不同企业的产品进行区分，为产品的质量评价提供技术参考。