金花葵花中药用成分分析

王瑞君，田 雨，吴佳文，王延峰，贾泽汉，白朕卿*，张秀娟

1延安大学 生命科学学院，延安 716000；2内蒙古科学技术研究院，呼和浩特 010018

金花葵(HibiseumanihotL.)为一年生草本锦葵科秋葵属植物，以花入药，药食同源且具有保健功能[1]。其主要功效为清热、凉血、解毒，清利湿热、解热抗炎、镇痛、抗疲劳、抗衰老、降血脂、抑制肿瘤细胞、增强免疫力、抗氧化等，此外还能够助消化，理气，润肠，美白，滋阴壮阳[2-5]。金花葵野生于北方山区，地域性独特，被生物界誉为“植物大熊猫”和“生命救心草”[6,7]。由于对其资源缺乏保护，金花葵被认为已灭绝。但是2003年8月在河北省邢台市发现了被认为已灭绝的金花葵资源，并且对其进行了保育，目前已经被广泛种植[8]。

金花葵的成分包括天然黄酮类化合物、不饱和脂肪酸、维生素E、维生素C、蛋白质、高聚糖胶、植物纤维、性激素及多种微量元素等[9]。其中黄酮类化合物是金花葵的主要生物活性物质，且含量超出目前黄酮生产常用原料银杏、大豆等数十倍[10]，是现在已知的植物中黄酮类含量最高的[11]。金花葵花总黄酮具有显著抑菌效果，且可以抑制酪氨酸酶活性影响黑色素细胞的生物合成进而起到美白功效，在医美方面有潜在的应用价值[12]。金丝桃苷为金花葵花中黄酮的主要成分[13]。金丝桃苷可以通过阻止钙离子进入神经细胞内起到镇痛作用，且人体对其没有依赖性[14]。金花葵花中的性激素含量也比补肾类植物高很多，其丰富的天然植物雌激素，对于延长女性青春期，减轻中老年更年期综合征也有奇效[15]。

目前对金花葵花的主要成分已经得到初步的分析，但有关不同花期药用价值的评价还未见报道。近些年，超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)作为一种快速而有效的多成分分析技术，具有灵敏度高、分离能力强、检测范围广等特点，已被广泛应用于中药的化学成分分析[16,17]。因此本研究通过超高效液相-串联四级杆飞行时间质谱对三组金花葵样品进行分析，鉴定金花葵鲜花、干花和花苞的成分，为阐明金花葵花期前后化学成分的变化规律以及为金花葵药用物质基础提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

金花葵为同一时期种植于内蒙古呼和浩特赛罕区生物技术研究所金花葵种植基地，开花期采集鲜花和花苞，将鲜花晾干制成干花，分别取干花、鲜花和花苞各6个样本用于后续实验测定。

1.2 UPLC-QTOF-MS方法

1.2.1 样品制备

金花葵干花经粉碎机粉碎后过100目筛；花苞、鲜花分别加液氮研磨成粉末，将三种处理好的样品分别精密称定0.1 g，置5 mL离心管中，加甲醇(色谱纯)3 mL，称量，超声(功率300 W，频率60 kHz)提取45 min，放置至室温，再称量，用甲醇(色谱纯)补足损失的量，滤过，取续滤液0.22 μm微孔滤膜滤过，即得三种待测样。质控样品由金花葵鲜花、干花和花苞提取溶液等体积混合得到。

1.2.2 色谱条件

采用ACQUITY UPLCTMI-Class和XevoG2XS QTOF联用；色谱柱为Waters BEH T3 1.8 m(2.1 mm×150 mm)；柱温40 ℃；梯度洗脱溶剂A为水溶液(含0.1%甲酸，甲酸为色谱纯)；B为乙腈(色谱纯)；梯度洗脱过程如下：97%A(0～1 min)、94%A(1～2 min)、88%A(2～2.5 min)、75%A(2.5～11 min)、50%A(11～13 min)、0%A(13～15 min)、0%A(15～17 min)、97%A(17～20 min)；流速为0.4 mL/min；进样量为10 μL。

1.2.3 质谱条件

电喷雾电离(ESI)离子源；采集质量范围为50-1 200 Da；离子化模式为ESI(+/-)采集MSE；毛细管电压为1.0 kV；离子源温度为100 ℃；雾化器温度为450 ℃；雾化器流速为800 L/h；锥孔电压为40 V；碰撞能量是低能4 V/高能15～60 V；数据处理软件为UNIFI 1.9.2。

1.2.4 数据定性与定量分析

采用UNIFI对差异物质进行定性分析；每张TOF MS一级谱图跟随10张二级全碎片扫描开启动态背景扣除DBS。利用超高100张/s的扫描速度，每个样品峰都采集18个数据点，保证了数据质量。在保证扫描点数的同时，一级、二级图谱都保证了30 000以上的高分辨率。利用m/z结合峰面积对物质进行定量分析。

1.3 数据处理与分析

采用AB SCIEX公司建立的天然产物质谱库扫描，直接调用在线Chemspider数据库检索鉴定化合物。UNIFI对数据进行PCA、PLSDA、OPLSDA分析，得到的标志物可以直接链接到UNIFI进行未知物定性分析。差异化合物分析使用Markerview软件处理后得到边缘性即差异大的离子，可以加入到Interest List，导入到Peakview中的Masterview进行峰提取，选择载荷图中边缘化的离子，t检验结果中P值小于0.05的离子。

2 结果与分析

2.1 金花葵干花、花苞和鲜花UPLC-Q-TOF-MS基峰强度离子分析

金花葵干花、花苞和鲜花样品在正离子和负离子模式下的UPLC-Q-TOF-MS基峰强度离子流图(BPI)示于图1，正负离子流数据分析，共识别了24个色谱峰，通过质谱裂解碎片分析并结合文献报道数据对照，正负离子两种模式下共鉴定出141种化合物。

图1 金花葵干花、花苞与鲜花提取液UPLC-Q-TOF-MS检测的负离子模式和正离子模式总离子流图

2.2 化合物鉴定

采用数据库检索流程和全未知物鉴定两种流程，对花中成分进行鉴定，正负离子两种模式下共鉴定出141种化合物。包括58个黄酮类化合物(正离子模式下推测出有牡荆素葡萄糖苷、槲皮素、红景天苷；负离子模式下所得芦丁、金丝桃苷、异槲皮素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、二氢樱黄素、二氢樱黄素-OCH2-葡萄糖苷、桑黄素-3-O-龙胆二糖苷、桑黄素、桑色素-葡萄糖鼠李糖苷、桑黄素-葡萄糖阿拉伯糖苷、杨梅素、杨梅素-葡萄糖苷、草夹竹桃苷等)，在负离子模式下共鉴定出27个有机酸类化合物(咖啡酸、柠檬酸、羟基柠檬酸、奎宁酸、香草酸等)，19个氨基酸类(在正离子模式下精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、酪胺、负离子模式下有组氨酸、色氨酸等)内源性化合物，此外，还含有11个脂类化合物、9个核苷类化合物、3个亚油酸等不饱和脂肪酸和一些糖类、五环三萜、环烯醚萜类等其他类别化合物，详细质谱数据列表见表1。

表1 详细化合物质谱数据列表

2.3 金花葵干花、花苞与鲜花的PCA分析

金花葵干花、花苞与鲜花样品在正离子和负离子模式下的UPLC-Q-TOF-MS数据PCA分析(见图2)。每个点代表一个样品，横、纵坐标分别为第一、第二主成分得分。结果显示无论是正离子模式还是负离子模式，干花和鲜花与花苞样品在第一主成分得分上有明显差异，即分别聚向横轴的相反方向；干花、花苞、鲜花在第二主成分得分上有明显差异，即分别聚向纵轴的相反方向；表明干花、鲜花、花苞三者UPLC-Q-TOF-MS数据的差异特征明显。

图2 金花葵干花、花苞与鲜花提取液UPLC-Q-TOF-MS的PCA得分图

2.4 金花葵花差异物质分析

差异化合物评判：一是负离子载荷图中边缘化的离子，负离子载荷图见图3；二是t-检验结果中P<0.05的离子。使用Markerview软件处理后得到边缘性即差异大的离子，可以加入到Interest List，导入到Peakview中的Masterview进行峰提取。金花葵花差异物质是判断其药用价值的关键。本研究分别对金花葵干花、花苞、鲜花的差异物质进行了比较分析。结果显示金花葵干花、花苞、鲜花中槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸、天师酸、蔗糖、木槿苷、槲皮万寿菊素、2,3-(S)-Hexahydroxydiphenoyl-D-glucose、木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖苷、槲皮素-3-O-(6′′-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、异金丝桃苷这九个成分有显著差异(见图4)。

图3 干花、花苞与鲜花的负离子载荷图

3 讨论与结论

金花葵全株富含黄酮类物质，可作为植物提取行业生产黄酮的工业原料，具有很大的开发与利用市场[18]。金花葵花、根、果皮、茎、种子5个部位中花的总黄酮含量显著高于其他部位[19]。金丝桃苷为金花葵花中黄酮的主要成分[20]，前人研究显示金花葵不同部位金丝桃苷含量分布为：花>叶>茎>根>籽[21]。金丝桃苷成分主要分布在其花中，在金花葵花的3个阶段(花蕾、鲜花、落花)中，金丝桃苷的含量高低依次为：花蕾>落花>鲜花，落花的含量为鲜花的1倍左右[22]。金花葵花中金丝桃苷，异槲皮苷在末期花中的含量约为初期花中的两倍[23]。此外，金花葵干花总黄酮含量居于首位[24]。本研究结果显示花苞内源性物质(如异亮氨酸、酪胺、N-甲基-a-氨基异丁酸)含量较鲜花和干花中高，而部分黄酮类化合物(如槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸、槲皮素-3-O-(6′′-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖苷、红景天苷、山奈酚-葡萄糖阿拉伯糖苷、异金丝桃苷、木槿苷、槲皮万寿菊素等)较鲜花和干花中低(见图4)。鲜花中部分黄酮类(如杨梅素、草夹竹桃苷，异槲皮素、牡荆素葡萄糖苷、红景天苷)和有机酸类化合物(香素酸、柠檬酸、羟基柠檬酸)，含量较干花和花苞中高。干花中部分黄酮类化合物含量(如桑色素、槲皮素、杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、桑黄素、杨梅素-葡萄糖鼠李糖苷、二氢樱黄素、羟基-甲基-杨梅素-葡萄糖苷)较鲜花和花苞中高。现有报道认为黄酮类化合物是金花葵的主要药效成分[25]，由化合物差异分析结果可知，鲜花和干花较花苞的药效成分多且含量高，如槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸、木槿苷、槲皮万寿菊素、2,3-(S)-六羟基二苯酚-D-葡萄糖、木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖、槲皮素-3-O-(6′′-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、异金丝桃苷等。

图4 金花葵干花、花苞与鲜花中主要药用活性成分分析

本研究建立了金花葵花的UPLC-Q-TOF-MS/MS快速分析方法，并鉴定了不同形式金花葵花内的主要有效成分。采用数据库检索流程和全未知物鉴定两种流程，对花中成分进行鉴定，正负离子两种模式下共鉴定出141种化合物，包括58个黄酮类化合物，27个有机酸类化合物，19个氨基酸类等内源性化合物，11个脂类化合物，9个核苷类化合物，3个亚油酸等不饱和脂肪酸和一些糖类、五环三萜、环烯醚萜类等其他类别化合物。此外，鲜花中与其他样品中有显著性差异的化合物为部分黄酮类和有机酸类化合物，含量较干花和花苞中高。干花中与其他样品中有显著性差异的化合物为部分黄酮类化合物，含量较鲜花和花苞中高。花苞中与其他样品中有显著性差异的化合物为内源性物质和部分黄酮类化合物，内源性物质含量较鲜花和干花中高，而部分黄酮类化合物较鲜花和干花中低。参考已报道的文献，认为黄酮类化合物是金花葵的主要药效成分，由化合物差异分析结果可知，鲜花和干花较花苞的药效成分多且含量高，具体与药效学结果是否一致，需进一步研究。

金花葵近年来受到广大学者的青睐，其药用活性成分的测定成为研究的热点[26]。金花葵具有较强的适应能力，我国南北地区都可种植[27]，其花朵不仅具有药用价值还可以制成花茶，也可研磨加工成粉，添加到粥或食品中[28,29]。黄酮类化合物在金花葵中的存在已有研究，但在花中却鲜有公布，本研究初步比对了三种不同类型金花葵花中的有机化合物，其成分多样，后期会充分对这些化学成分进行分离，鉴定和药理活性的研究，更进一步阐述金花葵干花，鲜花和花苞的药用价值。我们对金花葵花的主要活性成分含量进行研究，分析了金花葵花不同时期化学成分含量的差异，为金花葵不同花期入药研究奠定了基础，同时对阐明金花葵中物质基础提供了有力参考依据，有助于金花葵后期功能产品的开发及临床研究的应用。