2种6色流式细胞术试剂检测淋巴细胞亚群的性能比较

鞠颖慧， 莫惠芳， 吴 蕙， 陈 朴， 郭 玮， 王蓓丽

（复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032）

流式细胞术目前已广泛应用于淋巴细胞亚群分析、淋巴造血系统肿瘤免疫分型诊断和免疫功能测定等。淋巴细胞亚群检测项目包括T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）、辅助性T淋巴细胞（T helper cell，Th；CD3+CD4+）、细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL；CD3+CD8+）和自然杀伤（natural killer，NK）细胞（CD3-CD16+CD56+）。正常情况下，淋巴细胞数目稳定，疾病造成免疫功能异常可导致淋巴细胞数目改变，故其百分比及数量的测定可用于评估患者的免疫状态，作为诊断、治疗相关血液病和免疫缺陷疾病的重要依据，还可用于评价肿瘤患者、器官移植患者免疫治疗效果以及移植物的存活情况[1]。染色指数（staining index，SI）是衡量阳性细胞群和阴性细胞群分离程度的一个可靠指标，与阳性细胞群的平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）成正比，与阴性细胞群的MFI成反比，指数越大，分离效果越佳。目前，我国临床实验室使用的淋巴细胞亚群检测试剂多为进口试剂，价格偏高，配货周期长。为此，本研究拟对流式细胞术国产试剂与进口试剂检测淋巴细胞亚群的性能进行比较，验证2种试剂检测结果的可比性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2019年4—6月复旦大学附属中山医院就诊患者96例、上海市徐汇区中心医院就诊患者50例、合肥市疾病预防控制中心固定监测的获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者54例，共计200例，其中男115例、女85例，年龄19～86岁。

1.2 仪器与试剂

FACSCantoⅡ流式细胞仪（美国BD公司）及配套进口6色TBNK试剂盒（简称进口流式试剂，CD3-FITC/CD16-PE+CD56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PE-PC7/CD19-APC/CD8-APCCy7），TruCount绝对计数管（美国BD公司），7色仪器设置微球（美国BD公司），CS&T荧光校准微球（美国BD公司）。国产6色淋巴亚群检测试剂盒（简称国产流式试剂，CD3-FITC/CD16-PE+CD56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PEPC7/CD19-APC/CD8-APC-Cy7，北京同生时代生物技术有限公司）及配套绝对计数微球管。IMMUNO-TROL细胞质控品（美国贝克曼库尔特公司）。

1.3 方法

采用乙二胺四乙酸二钾抗凝管（美国BD公司）采集所有对象静脉血样本，均于当天检测完毕。FACSCantoⅡ流式细胞仪采用CS&T荧光校准微球和7色仪器设置微球校准到最佳状态，质控在控后分别采用国产和进口2种流式试剂检测淋巴细胞亚群（CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD19+细胞、CD3-CD16+CD56+细胞）。严格按仪器和试剂说明书操作。观察指标包括细胞百分比、细胞绝对数、每种细胞2种试剂在相同电压条件下的阳性峰和阴性峰间距、每种细胞百分比（绝对数）的线性范围等。在相同加样量、最佳光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）电压条件下，通过2种试剂的MFI和相对标准偏差（robust standard deviation，RSD）来对淋巴细胞亚群的SI进行比较，计算公式为：SI=[MFI（阳性）-MFI（阴性）]/2×RSD（阴性）[2]。计算2种试剂之间的平均偏移，公式为：偏移（%）=（Yi-Xi）/Xi×100%，式中Yi为国产流式试剂结果，Xi为进口流式试剂结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以±s表示，2个组之间比较采用配对t检验。呈非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用符号秩和检验。采用Spearman相关分析评估各项目之间的相关性。一致性采用组内相关系数（intraclass correlation coefficient，ICC）分析，ICC值的评价标准为：ICC＜0.4为可信度差，0.4～0.59为可信度中等，0.60～0.74为可信度良好，＞0.74为可信度优[3]。参考《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》[4]，将±5%作为允许误差范围，进行偏移的比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2种流式试剂检测结果比较

国产流式试剂的CD8+细胞和CD19+细胞百分比均低于进口流式试剂（P＜0.05），CD3+细胞百分比高于进口流式试剂（P＜0.05）。国产流式试剂CD3+细胞和CD19+细胞绝对数高于进口流式试剂（P＜0.05）。2种流式试剂检测CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD19+细胞和CD3-CD16+CD56+细胞百分比的平均偏移分别为0.41%、-0.35%、2.11%、3.33%、-4.98%，绝对数的平均偏移分别为3.89%、0.98%、4.83%、4.13%、0.95%。见表1、表2。

表1 2种流式试剂淋巴细胞亚群百分比比较 %

表2 2种流式试剂淋巴细胞亚群绝对数比较 个/μL

2.2 国产流式试剂与进口流式试剂检测结果的相关性分析

Spearman相关分析结果显示，国产流式试剂与进口流式试剂的淋巴细胞亚群检测结果的相关性良好（r＞0.9，P=0.000）。见表3、表4。

表3 国产流式试剂与进口流式试剂淋巴细胞亚群百分比检测结果的相关性

表4 国产流式试剂与进口流式试剂淋巴细胞亚群绝对数检测结果的相关性

2.3 国产流式试剂与进口流式试剂检测结果一致性分析

国产流式试剂与进口流式试剂CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD19+细胞和CD3-CD16+CD56+细胞百分比检测结果的ICC值[95%可信区间（confidence interval，CI）]分别为0.983（0.978～0.987）、0.990（0.986～0.992）、0.989（0.986～0.992）、0.987（0.983～0.990）、0.991（0.989～0.993），绝对数的ICC值（95%CI）分别为0.955（0.940～0.965）、0.970（0.961～0.977）、0.958（0.944～0.968）、0.992（0.989～0.994）、0.967（0.957～0.975），ICC值均＞0.95（P＜0.001）。2种流式试剂有较好的一致性。

2.4 国产流式试剂与进口流式试剂SI分析

国产流式试剂对CD3+细胞、CD8+细胞的SI高于进口流式试剂（P＜0.05），对CD4+细胞、CD19+细胞、CD3-CD16+CD56+细胞的SI低于进口流式试剂（P＜0.05）。见图1。

图1 国产流式试剂与进口流式试剂SI比较

3 讨论

淋巴细胞亚群检测可对影响机体免疫系统的多种因素的监测提供重要信息[5]。CD4+淋巴细胞计数是监测AIDS患者病情进展和疗效评价的重要指标[6]。淋巴细胞亚群检测也可用于急性白血病和淋巴瘤的初筛，能发现异常细胞及其表达的标志物。恶性肿瘤患者也存在免疫异常，外周血T淋巴细胞和NK细胞监测可提供一定的参考依据。目前，流式细胞术是公认的用于分析淋巴细胞亚群的“金标准”[7]，然而，由于进口流式试剂价格昂贵，且配货周期长，因此如何选择适合自己实验室需求的国产流式试剂成为各临床实验室面临的重要问题。为此，本研究对国产流式试剂的检测性能进行了验证。

本研究收集了3家实验室的200例样本，确保淋巴细胞亚群覆盖低、中、高3个水平。结果显示，国产流式试剂的CD3+细胞、CD8+细胞、CD19+细胞百分比及CD3+细胞、CD19+细胞绝对数检测结果与进口流式试剂比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。但该差异仅能反映淋巴细胞亚群检测结果均值或中位数的差异，无法反映数据的一致性。因此，还需通过分析检测结果的一致性或可靠性来衡量这种差异造成的影响。ICC可用于评价不同测定方法或评定者对同一定量测量结果的一致性或可靠性，0表示不可信，1表示完全可信[8]，一般认为ICC＞0.74为可信度好。本研究2种流式试剂之间的r值和ICC值均＞0.9，可确认2种流式试剂检测淋巴细胞亚群百分比和绝对数的一致性较好，结果具有可比性。在流式细胞分析中，阴、阳性抗原细胞的区分也十分重要，抗原阴性细胞或者碎片的背景荧光会影响结果的准确性，所以应选择染色效果好的试剂。本研究结果显示，虽然荧光抗体、细胞数量、染色时间、PMT相同，但是国产流式试剂与进口流式试剂SI的差异依然有统计学意义（P＜0.05）。这可能是导致2种试剂检测淋巴细胞亚群百分比和绝对数存在差异的原因之一。本研究CD4+细胞的检测结果与严艳等[9]结果一致。

目前，用于淋巴细胞亚群检测的样本的处理和结果分析还是通过人工完成，未实现全自动化，因此淋巴细胞亚群检测的影响因素较多。在相同的仪器和试剂条件下，仪器的状态（电压、荧光补偿、阈值设定等）、样本前处理（加样量不准、红细胞裂解不完全等）、淋巴细胞散点图分析方法等因素可能是淋巴细胞亚群检测结果出现差异的主要原因。另外，试剂厂商荧光抗体的选择也会对淋巴细胞亚群检测结果产生影响。本研究使用的进口流式试剂和国产流式试剂均采用相同的荧光染料，但克隆号、免疫球蛋白亚型、抗体种属、发射峰等的不同可能也会导致检测结果出现差异。根据厂家试剂说明书，本研究使用的进口流式试剂与国产流式试剂中CD3的克隆号分别为SK7、UCHT1，CD8的克隆号分别为SK1、HIT8a，其他项目的克隆号未能查证。此外，患者的种族和抗原决定部位表达的个体差异也会对检测结果产生影响[10]。由于目前我国流式细胞检测结果的质量控制尚无统一的标准[11]，因此本研究参考《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》[4]进行偏移的比较，结果显示，2种试剂检测淋巴细胞亚群的结果偏移均在可接受范围内。

综上所述，国产流式试剂与进口流式试剂检测淋巴细胞亚群的结果虽有一定的差异，但相关性和一致性均较好。各临床实验室可根据自己的需求来选择合适的抗体试剂。