以MRP2/MRP3转运体为作用靶点的何首乌中肝毒性成分筛选△

汪祺，文海若，马双成

中国食品药品检定研究院，北京 100050

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.P.M.的干燥块根，自古以来是历代医家广为推崇的补益药和抗衰老药，具有补肝肾、益精血、乌须发的功效[1]，临床应用较广。随着何首乌及其制剂在临床的长期应用，其引发的不良反应引起了关注，特别是有关何首乌致肝损伤的报道层出不穷，相关不良反应报告超过2 万份[2-5]。何首乌引起的药源性肝损伤位居全部中药肝损害病例数量第1 位[6]。2014 年，原国家食品药品监督管理总局发布了何首乌及其相关制剂可引发肝损伤的预警。因此，阐释何首乌导致肝损伤的具体作用机制和作用靶点、进一步明确其肝毒性成分成为急需解决的问题。

各种原因引发的胆汁酸代谢障碍或胆红素代谢受阻可引发胆汁淤积，继发肝损伤。因此，胆汁淤积的发生与体内胆汁酸、胆红素代谢通路中多种转运蛋白密切相关，如多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance associated protein 2，MRP2）和MRP3等[7]。MRP2 在体内主要负责胆酸盐的排泄，同时介导胆红素及其葡萄糖醛酸结合物排入胆汁，其高表达于肝脏、肠及肾脏组织。MRP3 则主要将胆酸盐从肝细胞转运到血窦，为基底侧外排的代偿途径。研究表明，MRP2、MRP3 蛋白功能受到影响时肝脏表现出不同程度的胆汁酸或胆红素淤积，继而产生毒性反应[8]。有研究表明，由于MRP2、MRP3 为胆红素及胆汁酸主要外排转运体，当两者受阻时，可引发胆红素和胆汁酸代谢循环障碍，继而淤积产生肝毒性，而上述表现与何首乌及其制剂临床引发的肝损伤症状极为相似，均为黄疸及胆汁淤积[9-10]。

基于此，本课题组推测何首乌引发的肝损伤与其作用于外排转运体MRP2、MRP3 高度相关。因此，本研究以MRP2、MRP3为切入点，结合体外计算机分子对接技术和肝细胞毒性实验，筛选何首乌中潜在的肝毒性化合物。

1 材料

1.1 细胞

人源肝细胞HepaRG 购自美国菌种保藏中心（ATCC）。

1.2 试药

胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）均购自Gibco公司；DuRed核酸染料（北京富百科生物技术有限公司）；Real SYBR Mixture、琼脂糖均购自Spain Biowest 公司；2×TaqPCR MasterMix、总RNA 提取试剂盒、cDNA 第一链合成试剂盒、D2000 DNA Marker 均购自北京厚生博泰生物技术有限公司；2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（反式二苯乙烯苷，批号：110844-201915，纯度：90.7%）、大黄素（批号：110756-201913，纯度：96.0%）均购自中国食品药品检定研究院；芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号：B20773，纯度＞98.0%）、胆红素（批号：B20273，纯度＞98.0%）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号：B20241，纯度＞98.0%）均购自上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司）。

1.3 仪器

Line Gene 9620 型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测系统FQD-96A 型基因扩增仪（杭州博日科技股份有限公司）；EDC-810型PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司）；Nano-100 型分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）；VICTOR X5 型多功能酶标仪（PerkinElmer 公司）；LEGEND MICRO17 R 型台式高速冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific公司）；Vortex-Genie 2 型涡旋振荡器（Scientific Industries 公司）；GravityPlus™、GravityTRAP™型滴板（Insphero公司）。

2 方法

2.1 分子对接

选择48 个何首乌中所含的主要单体成分（化合物主要来源于文献报道[11-13]及中国天然产物化学成分数据库，包括二苯乙烯苷类、蒽醌类、蒽酮类等）进行对接测定。首先采用Discovery Studio 2.5 功能模块对上述单体分子进行预处理，预处理过程主要包括三维结构的生成、结构的优化、删除重复的结构等，最终得到48 个化合物的化学结构；其次，基于生成的结构构建配体库，以此为基础进行后续虚拟筛选[14-15]。

以“MRP2”“MRP3”为关键词检索SWISSMODEL 数据库（https://swissmodel.expasy.org/），根据筛选规则获得1 个同源模建结构，MRP2 及MRP3模板的PDB 编号为6uy0。根据文献记录的氨基酸残基定义活性位点[16-17]，MRP2 半径为1.742 387 nm，位点的三维坐标位置为157.158 707、176.372 707、163.243 586，关键氨基酸残基为LYS295、VAL434、SER481、SER484、LYS485、ILE583、SER594、SER602、MET603、THR1144、ARG1146、CYS1196、CYS1196、ASN1253、ARG1257、SER1260、GLU1261；MRP3 的半径为1.517 338 nm，位点的三维坐标位置为171.206 066，173.948 148，165.653 377，关键氨基酸残基为GLN321、GLN363、THR1237、PHE1238、TRP1242、ARG1245。选择以MRP2、MRP3 为主要转运蛋白并具有肝毒性的胆红素作为底物进行初步对接模型验证[18-20]。

2.2 肝细胞毒性考察

于96 孔板中每孔接种对数生长期的HepaRG 细胞约5000 个（密度为5×104个/mL），孵育24 h 后给予待测单体。实验设置空白对照组（不含HepaRG细胞）、对照组（0.5%DMSO）、阳性对照组（胆红素）及不同质量浓度的待测单体给药组（反式二苯乙烯苷为15、40、150、400 μg·mL-1，大黄素为15、40、150、400 μg·mL-1，大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷为15、30、150、400 μg·mL-1，芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷为1、3、10、30 μg·mL-1）。将孵育体系置于37 ℃、5%CO2条件下24 h。每孔加入细胞活力检测试剂（CCK-8细胞计数试剂盒）10 μL，37 ℃避光孵育2 h后采用酶标仪在450 nm波长下检测各孔的吸光度（A）。按照公式（1）计算细胞存活率[21]，并根据细胞活率计算半数抑制浓度（IC50）[14-15]。

2.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验

HepaRG 细胞分别与0.1、1.0、10.0 μmol·L-1目标化合物（芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、反式二苯乙烯苷和大黄素）作用24 h后，每组收集不少于1×106个细胞用于qRTPCR 检测，考察其对HepaRG 细胞中MRP2、MRP3 mRNA 表达水平的影响。平行设置对照组（0.5%DMSO）。MRP2、MRP3 mRNA 的表达量以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参，进行相对定量。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列相关信息见表1。样本总RNA 经通用型总RNA 提取试剂盒提取，RNA 质量浓度和纯度采用Nano-100型分光光度计测定。用cDNA 第一链合成试剂盒进行cDNA 反转录，并进行qRT-PCR 检测[14-15,22-23]。PCR反应条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s（循环40次）。

表1 qRT-PCR实验引物序列

3 结果

3.1 分子对接实验结果

MRP2、MRP3 蛋白结构见图1，与胆红素对接打分值分别为156.977、153.491。48 个待测单体化合物对接结果见表2～3（25 个目标化合物无法与MRP3 结合，34 个目标化合物无法与MRP2 结合）。以具有肝毒性的MRP2、MRP3 底物胆红素作为参照，选取其打分值的80%作为参照[23-25]，规定潜在肝毒性化合物得分应不低于125.582（MRP2）和122.793（MRP3）。与MRP2 对接结果显示，大黄素-6-O-β-D-葡萄糖苷，大黄素甲醚-8-O-β-D-(6′-O-乙酰基)-葡萄糖苷、反式二苯乙烯苷打分值高于胆红素打分值的80%，可被初步认定为潜在毒性成分；与MRP3对接结果显示，大黄素-6-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-(6′-O-乙酰基)-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷及芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷等打分值均高于胆红素打分值的80%，可被初步认定为潜在毒性成分。

图1 MRP2、MRP3蛋白结构

表2 何首乌成分与MRP2对接结果

3.2 肝细胞毒性考察结果

根据对接得分，选取何首乌中具有代表性且含量较高的单体反式二苯乙烯苷、芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素进行体外细胞毒性考察。由实验结果（图2）可知，大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（IC50为21.37 μg·mL-1）和芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（IC50为6.96 μg·mL-1）表现出较明显的肝细胞毒性作用；反式二苯乙烯苷表现出中等肝细胞毒性作用（IC50为42.77 μg·mL-1）；大黄素（IC50为62.81 μg·mL-1）肝细胞毒性作用相对最小。体外肝细胞毒性实验结果与分子对接打分值结果相一致。

图2 何首乌中不同化合物对HepaRG细胞活性的影响（,n=5）

表3 何首乌成分与MRP3对接结果

3.3 单体对MRP2、MRP3转运体表达的影响

由结果可知（图3），与对照组比较，大黄素-8-O-葡萄糖苷及芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷均可显著下调HepaRG 细胞中MRP2 mRNA 表达水平（P＜0.05），上调MRP3 mRNA 表达水平（P＜0.05），且作用存在剂量效应相关性；反式二苯乙烯苷及大黄素对MRP2 mRNA 表达影响较小，但可显著上调MRP3 mRNA表达水平（P＜0.05）。结合肝细胞毒性实验结果，初步推测大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷可通过影响MRP2、MRP3，扰动胆红素、胆汁酸代谢循环，继而引发肝损伤。反式二苯乙烯苷及大黄素对MRP2 的影响较小，二苯乙烯苷与MRP2 对接得分值仅为胆红素得分值的80%，其对MRP2 的影响仍需进一步考察验证。

图3 何首乌中不同化合物对HepaRG细胞MRP2、MRP3 mRNA表达水平的影响（,n=5）

4 讨论

截至目前，有关何首乌中肝毒性成分的研究方法涉及肝微粒体孵育法、体外细胞法、微组织芯片法、在体灌流法，以及采用大鼠、小鼠进行体内实验等。杨敏等[26]采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，检测了何首乌中11 个单体成分（包括游离蒽醌、结合蒽醌及萘类）的体外肝细胞毒性，将毒性较强的单体进行大鼠肝匀浆物孵育实验，进一步验证其肝毒性作用。另有研究发现，何首乌及其炮制品均可抑制原代肝细胞增殖，同时可影响胆红素及胆汁酸的正常代谢[27]。MRP2、MRP3 是胆红素及胆汁酸重要外排转运体，胆汁淤积的临床特征为MRP2转运体下调且MRP3代偿性上调，加速胆酸盐及胆红素从肝细胞转运至血窦[28]。因此当毒性成分作用于这2 个靶点蛋白时，存在引发肝毒性的风险。因此，本研究以MRP2、MRP3 转运蛋白为切入点，采用计算机分子对接技术对何首乌中48 个代表性单体进行高通量筛选；选取与MRP2、MRP3对接打分值较高同时在何首乌中含量较高的单体进行体外肝细胞毒性验证；此外，从基因层面进一步验证待测单体是否对MRP2、MRP3 产生影响。经实验发现，体外肝细胞毒性实验及靶蛋白基因测定结果与分子对接实验预测基本相一致。分子对接得分较高的大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷在体外细胞毒性实验中显示出较强的毒性作用，同时mRNA 表达水平测定结果提示两者可对MRP2、MRP3 转运体的表达量产生影响，存在引发胆红素胆汁酸代谢异常产生肝毒性的可能，这与窦志华等[29]研究发现的大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷为大黄中主要肝毒性蒽醌类成分的结论相一致。反式二苯乙烯苷类是何首乌中一类重要组成成分，在生、制首乌中含量存在明显差异[30]。部分学者认为二苯乙烯苷有保肝作用[31-33]。然而另有研究表明二苯乙烯苷具有一定肝脏毒性[34-35]。本研究中，反式二苯乙烯苷体外细胞实验中表现出中等细胞毒性，而其对MRP2 mRNA 表达水平的影响作用并不显著，这与分子对接结果存在差异，二苯乙烯苷与MRP2 对接得分值仅为阳性对照胆红素得分值的80%，可能需调整其作用浓度，并对作用时间开展进一步实验验证。本研究结果可为何首乌临床用药的安全性评价提供参考。