基于形性与化学指标关联分析的当归挥发油质量评价和当归产地鉴别△

程亚茹，石秀佳，龚燚婷，杨丽，李宇，董玲*，陈建波*

1.北京中医药大学 生命科学学院，北京 100029；2.北京中医药大学 中药学院，北京 100029

当归是伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的作用[1]。挥发油被认为是当归的主要活性物质群组之一，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版规定其质量分数不得低于0.4%[1]。当归挥发油的组成复杂，文献报道其含有苯酞类、烯烃类、酚类等多种成分，以藁本内酯、丁烯基苯酞和正丁基苯酞等成分的含量较高[2-4]。现代研究表明，当归挥发油具有活血、解痉、抗炎镇痛等多种药理活性。因此，挥发油是当归质量评价的重要指标之一。

气味和颜色鉴别是传统中药鉴别的要点，与药材的质量密切相关，对药材的真伪鉴别、产地鉴别和临床应用等具有一定的指导意义[5-6]。气味和颜色也是评价当归质量的重要形性指标，《本草纲目》中记载“色紫气香”的当归质量优良[7]，《中国药典》2020 年版描述为“表面浅棕色至棕褐色……有浓郁的香气”[1]。本课题组前期提出建立基于“形性-化学-生物”指标的综合质量指标体系[8]，现代药效物质基础研究阐述了化学成分与药效之间的关联性[9-10]。“辨状论质”是通过形性指标评判药材品质的规律总结，但其中的科学内涵尚未阐释清楚[11]，缺乏形性指标与化学指标的相关性研究。故本研究对当归颜色指标、气味指标和挥发油中14 个成分含量进行关联性分析，为通过形性指标分析挥发油化学指标特点及通过综合指标鉴定当归产地提供参考。

1 材料

1.1 仪器

CM-5型分光测色仪（日本柯尼卡美能达公司）；α-FOX3000 型气味指纹分析仪（法国Alpha M.O.S公司）；7890B 型气相色谱仪（美国Agilent 公司）；CPA225D型电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

对照品藁本内酯（批号：DST200610-007，纯度≥98%，成都乐美天医药科技有限公司）；丁烯基苯酞（批号：Y05S9W67682，纯度≥98%）、正丁基苯酞（批号：S09J9D65229，纯度≥98%）均购于上海源叶生物科技有限公司；蒎烯（批号：RH121566，纯度≥98%，上海易恩化学技术有限公司）；甲醇（分析级，北京市通广精细化工公司）。

收集不同产地当归药材38批，其中甘肃产16批、云南产10 批、青海产6 批、四川产6 批，经中国中药协会首席科学家张世臣教授鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具体信息见表1。

表1 当归药材信息

2 方法

2.1 当归色度测定

CM-5 型分光测色仪的光源设置为D65，视场选择10°视角，测量波长为380～780 nm，每次开机用黑板和白板对仪器进行校正、调零后进行样品测定。当归粉末取适量于测色皿内，高度约0.5 mm，以测色时不透过光源为准，测定并记录颜色指标L*、a*、b*值，每个样品平行测定3份。

2.2 电子鼻测定

各批当归药材样品随机取样，粉碎过二号筛，称取0.3 g装入10 mL 顶空进样瓶，压盖密封。电子鼻顶空温度为45 ℃；顶空时间为600 s；振荡速度为250 r·min-1；进样针温度为55 ℃；进样体积为1000 μL；流速为150 mL·min-1；采集时间为120 s；采集间隔为1 s；延滞时间为600 s。每个样品平行测定3次。

2.3 当归挥发油气相色谱测定

2.3.1色谱条件 色谱柱为HP-5（30 m×250 μm，0.25 μm）；载气为N2；流速为1.0 mL·min-1，恒定流量；进样量为2 μL，不分流进样；初始温度为70 ℃，以5 ℃·min-1升温至130 ℃，保持5 min，以0.1 ℃·min-1升温至133 ℃，保持2 min，以10 ℃·min-1升温至230 ℃，保持5 min；后运行以230 ℃运行3 min；进样口温度为250 ℃，检测器温度为280 ℃。

2.3.2供试品溶液的制备 取当归药材粉末约100 g，称定质量（准确至0.01 g），置烧瓶中，加10 倍量水，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。置电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸约5 h，停止加热，静置，计算挥发油提取率，收集提取的当归挥发油储存于-20 ℃冰箱中，备用。

2.3.3对照品溶液的制备 取藁本内酯、正丁基苯酞、丁烯基苯酞和蒎烯对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇配制成一定质量浓度的溶液，即得。

2.3.4方法学考察 任意选取1 批当归挥发油样品，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液进行检测，按照2.3.1项下气相色谱条件连续进样6次，记录色谱图，考察仪器的精密度；分别于0、2、4、8、12、24 h 时进样检测，考察供试品溶液的稳定性；同时制备6 份供试品溶液，连续进样，考察供试品溶液的重复性。计算各成分相对含量的RSD。

2.3.5样品测定 取当归挥发油（水蒸气蒸馏提取）约10 mg，精密称定，置量瓶中，加甲醇溶解制成5 mg·mL-1的溶液，摇匀，取溶液续滤液，注入气相色谱仪进行测定。以相对峰面积与挥发油提取率的乘积表征当归药材中各成分的相对含量。

3 结果与讨论

3.1 当归的特征颜色指标与产地差异

各批次当归样品颜色指标（L*、a*、b*）测定结果如表2 所示，将其导入JMP 10 软件进行主成分分析（PCA），得到特征颜色指标载荷图（图1）和PCA 图（图2）。主成分1（PC1）的方差贡献率为61.1%，PC2 的方差贡献率为36.9%，累积方差贡献率为98.0%，表明PC1和PC2可以解释说明98.0%的原始颜色信息，故以PC1 和PC2 进行载荷图和PCA 得分图分析。对载荷图中不同指标进行相关性分析可知，L*和a*指标间具有较强的负相关，a*与b*指标间呈正相关，L*和b*指标间相关性较弱。

表2 当归样品色度测定结果（n=3）

图1 当归颜色指标载荷图

由PCA 得分图（图2）可知，不同产地当归样品可根据颜色指标进行明显区分。其中云南产样品的PC1 得分值较小，说明L*值较大，表明云南当归颜色较其他3 个产地样品浅；甘肃产样品与四川、青海2个产地样品相比，PC2得分值较大，表明b*值较大，颜色偏黄；四川和青海产样品的颜色差异体现在PC1 得分，青海样品的a*值较大。中药材的颜色受品种、产地、采收时间、炮制和贮藏等因素影响[12]，云南纬度较低，气候较甘肃温暖湿润，沾益区种植当归的土壤为红壤而非甘肃和四川的灰棕壤或黄壤，并且常采用直播1 年生的方式栽培当归以缩短生长周期[13-15]，同时当归颜色与藁本内酯、阿魏酸、多糖等成分含量具有一定的相关性[16-17]，故推测云南当归颜色偏浅与其气候、土壤、种植方式、化学成分等因素有关。

图2 当归颜色指标主成分得分

3.2 当归的特征气味指标与产地差异

38批当归样品根据产地信息进行分组后，将12个传感器的最大响应值绘制雷达图（图3）。由图3 可知，不同产地当归样品的气味在各传感器上均有一定的差异，且以传感器LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl 的检测值差异显著；云南产地样品各传感器的响应值绝对值均高于其他产地，表明其气味强于其他产地的当归样品；其余3 个产地样品气味差异则不明显。

图3 当归样品的气味雷达图

将电子鼻12个传感器的最大响应值导入JMP 10软件进行PCA，计算得到各主成分的方差贡献率，气味指标载荷图（图4）中显示，PC1和PC2的累积方差贡献率为99.52%，足以反映当归的气味信息。12 个传感器指标明显被分为3 类：第1 类为LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl和LY2/gCT；第2类为T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2 和PA/2；第3类为LY2/LG。第1类传感器响应值与第2、3类传感器响应值具有显著的负相关；第2类和第3类传感器响应值之间具有较强的正相关；同类型指标在载荷图中基本重叠，表明其有显著的正相关。第1 类传感器（LY2 型）对氨气/有机胺类、一氧化碳、乙醇、硫化氢和丙烷/丁烷等较为敏感；第2 类传感器（P/T 型）对有机溶剂、烃类、甲烷、氟、乙醇、氨气/有机胺类和芳香族化合物较为敏感；第3 类传感器对氧化气体敏感。气味物质基础相关研究表明，部分LY2 型传感器与烯烃类、酮类成分具有相关性[18]，某些酯类化合物（乙酸丁香酚酯、癸酸乙酯等）与P/T 型传感器的相关性强于LY2 型传感器[19]，烯烃类、酯类和醇类等化合物是气味的重要物质基础[20-21]。对当归挥发油化学指标与电子鼻结果进行关联分析，以探究当归气味的物质基础。参考文献[22]方法，在3 类指标中分别选取传感器LY2/gCTl、P10/1和LY2/LG为代表以简化后续分析。

图4 当归样品的气味指标载荷图

由气味指标PC1 和PC2 所构成的PCA 得分图（图5）可明显将云南样品与其他产地样品进行分离，青海、四川和甘肃的当归样品在气味信息上具有一定的区分度，但是不能明显分离。云南样品PC1 得分值较大，表明第2 类和第3 类传感器的响应值较大，与图3 结果相符；青海样品与甘肃样品具有较好的分离度，但与部分四川样品重合；四川与甘肃样品在得分图中相对聚集，表明气味特征较为相似。

图5 当归样品的气味指标PCA得分

3.3 当归的挥发油化学指标与产地差异

3.3.1共有化合物指认 当归挥发油气相色谱图中根据tR共筛选出14 个共有化合物（图6），通过前期研究基础、对照品比对和查阅文献[23]，对共有化合物进行指认，结果见表3。

表3 当归挥发油共有化合物指认

图6 不同产地当归挥发油GC图

3.3.2当归挥发油化学指标相关性及产地差异 精密度试验结果表明，各成分保留时间和相对峰面积的RSD 分别小于0.1%和3.5%，仪器精密度良好；稳定性试验结果表明，在24 h 内，各成分保留时间和相对峰面积的RSD 分别小于0.2%和4.5%，供试品溶液稳定性良好；重复性试验结果表明，各成分保留时间和相对峰面积的RSD 分别小于0.1%和5.2%，试验重复性良好。

将当归挥发油中各化学成分含量导入JMP 10 软件进行分析，各成分在载荷图（图7）中聚集为2类，即第1 类为烯烃类成分包括C1～C8；第2 类为苯酞类成分包括C9～C14。由图7 可知，第1 类化学成分与第2类化学成分之间相关性较弱；但是同类型指标在图7 中聚集，表明其正相关关系显著。参考文献[22]方法并考虑化合物的含量，后续分析中选取C2和C11代表挥发油类化学成分指标。图7中显示，PC1和PC2的累积方差贡献率为76.0%，可提取当归挥发油化学指标的大部分有效信息。

图7 当归挥发油化学指标载荷图

PC1 和PC2 得分构成的PCA 得分图（图8）显示，4个产地样品可分为3类，其中云南样品与其他产地当归样品之间界限清晰，PC1 得分较高，表明云南样品中第1 类成分的含量较高；青海样品与甘肃、四川当归样品可基本分离，PC2 得分较低，表明第2 类成分的含量较低；甘肃、四川当归样品的PC1得分较低，PC2得分较高，表明2个产地的当归样品第1类成分含量较低，第2类成分含量较高。

图8 当归挥发油化学指标PCA得分

3.4 当归颜色、气味指标与挥发油化学指标关联性分析

将筛选得到的颜色特征（L*、a*、b*）、气味特征（LY2/gCTl、P10/1和LY2/LG）和化学指标（C2、C11）数据导入JMP 10软件进行PCA和相关性分析，研究不同指标间的关联性及整体指标对产地的区分效果。

由图9可知，指标L*、LY2/LG、P10/1和C2之间有明显的正相关，与a*、LY2/gCTl 指标具有明显的负相关；C11与P10/1 具有正相关，与a*、b*2 个颜色指标具有负相关，与其他指标相关性较弱；b*与a*具有正相关，与C11、P10/1具有负相关，与其他指标相关性较弱。综合指标的PCA 得分图（图10）中显示，不同产地的当归样品明显区分。其中甘肃样品较分散，位于得分图左上区域的样品a*、b*、LY2/gCTl的检测值较高，位于Y轴负值附近样品的C11含量较高；云南样品的PC1 得分值较高，表明其L*、LY2/LG、P10/1和C2等指标的检测值较高；青海样品PC1得分较低，表明其a*、LY2/gCTl指标的检测值较高；四川样品PC2得分较低，表明其C11含量较高。

图9 当归颜色、气味指标与挥发油化学指标载荷图

图10 当归颜色、气味指标与挥发油化学指标PCA得分

运用JMP 10 软件进行颜色、气味和化学成分之间的关联性分析，计算不同指标之间的Spearman 相关系数（ρ），见表4。结果表明，C2与LY2/LG、P10/1、L*指标呈显著正相关，与LY2/gCTl、a*指标呈显著负相关，与b*无显著相关性；C11与P10/1 呈正相关，与a*指标呈负相关，与其他指标无显著相关性；气味特征LY2/LG、P10/1 与颜色特征L*呈正相关，与a*呈负相关；气味特征LY2/gCTl与L*呈显著负相关，与a*呈正相关。由于其中LY2/gCTl 传感器的感应值为负值，其信号越强，感应值越小，所以C2与C11所代表的2 类成分与气味特征强弱均为正相关，即挥发油类成分的含量越高，其气味特征越强。其中C2与气味特征的相关系数高于C11，故推测当归药材气味特征的物质基础可能主要为烯烃类成分。C11所代表的苯酞类化合物仅与气味传感器P10/1所代表的第2类传感器具有显著正相关。

表4 当归颜色、气味指标与挥发油化学指标之间的关联性分析

对不同产地8 个特征指标进行分析（图11）可知，L*、LY2/LG、P10/1、C2在不同产地之间变化趋势相一致，呈正相关，与a*、LY2/gCTl 变化趋势相反，呈负相关，其他指标b*、C11变化趋势无明显一致性，相关性较弱，与关联性分析结果基本一致。在产地差异方面，甘肃样品的颜色指标b*最高；云南样品的颜色指标L*，气味指标LY2/LG、P10/1，化学指标C2等测定值最高；青海样品的颜色指标a*、气味指标LY2/gCTl 的测定值最高；四川样品C11的含量较高，与前期PCA结果基本一致。

图11 不同产地当归特征指标差异性分析

4 小结

传统性状和化学指标是评价中药质量的重要指标，中药的颜色与气味是传统性状中的关键指标，与中药化学成分具有显著关联性。柴冲冲等[24]研究发现，黄芩中黄芩苷与汉黄芩苷含量与L*、b*，E*呈显著正相关，与a*呈显著负相关；黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A则呈现相反规律；肉豆蔻中萜烯类、醇类和酯类化合物的改变导致其气味发生显著的变化[25]。对于当归而言，当归的颜色与阿魏酸、藁本内酯和多糖等具有显著相关性[16-17]；Zheng 等[26]研究表明，当归的成分和气味之间具有一定的关联性。李泽仟等[27]则认为6-十一酮、藁本内酯、丁烯基苯酞等化合物为当归的主要气味物质基础。本研究通过PCA 和相关性分析，进一步研究颜色、气味和挥发油成分指标之间的相关性。研究结果表明，当归气味传感器的响应值越强，颜色越浅，当归药材中烯烃类和苯酞类成分的含量越高；其中烯烃类成分与气味的相关性强于苯酞类成分，故推测当归药材气味特征的物质基础可能主要为烯烃类成分。

道地药材作为我国优质中药材的代表，其质量优劣与临床药效密切相关，因此对道地药材和非道地药材的鉴别至关重要[28]。现有研究表明，不同产地的当归样品在外观性状[29]、颜色[16]、气味[30]、化学成分[31]等方面均具有一定的差异，可根据其外在性状和内在成分区分产地。本研究PCA 结果显示，云南样品与其他3 个产地差异显著；青海样品基本可与甘肃、四川样品分离；甘肃和四川样品较为相似，在以颜色和综合指标进行分析时可进行区分，建立的综合指标鉴别产地的方法区分效果良好。

综上所述，当归的颜色、气味和挥发油化学指标之间具有显著的相关性，其颜色和气味等形性指标可反映当归药材中挥发油化学指标的特点，从而判断当归挥发油的质量；建立的综合指标鉴定产地的方法则可明显区分4 个产地的当归药材，其区分效果优于气味、挥发油化学成分单个指标鉴定产地的方法。本研究通过深入分析形性指标与化学指标的关联性，将形性指标作为一种表征化学指标的简单检测方式，为建立简便快捷的当归质量评价方法提供参考。