基于ITS2条形码的市售延胡索鉴别△

范晓玉，王亚丹，邵平，韩凌，吕重宁*，路金才*

1.沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳 110016；2.国家中成药工程技术研究中心，辽宁 本溪 117004

延胡索药材为罂粟科（Papaveraceae）植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥根茎，其味辛、苦，性温，具有活血、行气、止痛的功效，用于胸胁、脘腹疼痛等证[1-2]。研究表明，延胡索通过其主要活性成分生物碱（如原阿片碱、延胡索乙素等）发挥镇痛、抗炎、抗肿瘤等作用，临床上应用广泛[3-5]。

延胡索与余零子、水半夏、夏天无、齿瓣延胡索等多种药材外形极为相似，很容易混淆[6]。以传统鉴别方法区分延胡索与其混伪品有一定难度，因此，建立一种快速有效的延胡索鉴别方法对其临床用药安全至关重要。DNA 分子鉴定技术是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA 片段来进行物种鉴定的分子诊断技术[7]。内转录间隔区2（ITS2）最早被应用于系统发育和物种的分类研究，在药用植物及其混伪品的鉴别中具有显著的优势[8-9]。已有研究将DNA 条形码技术用于延胡索及其混伪品的鉴别，许灿新[10]对延胡索及其同属的4种混伪品进行鉴别，以药材新鲜块茎为研究对象，对比了ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK4 个条形码的鉴别能力，结果发现ITS2 序列可以较好完成延胡索及其混伪品的鉴别；王丹依等[11]也利用ITS2 序列成功鉴别了紫堇属包括延胡索在内的6种植物。

现有研究均以延胡索的植物叶片或者新鲜块茎为对象，而市售延胡索饮片都是经过高温蒸煮、醋炙或醋煮等的炮制加工品，其DNA 降解严重，聚合酶链式反应（PCR）扩增困难，鉴别难度较大[12]。因此，本研究以延胡索加工品为研究对象，在文献研究的基础上，采用改良后的试剂盒法提取样品DNA，选取ITS2 条形码对市售延胡索进行真伪鉴别，以评价ITS2序列对延胡索加工品的鉴别能力。

1 材料

1.1 试药

60 份市售延胡索饮片来自安徽中药材市场或延胡索的主要产地浙江、陕西，样品经沈阳药科大学中药学院路金才教授鉴定均为延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥根茎，具体信息见表1。同时，从GenBank 的Nucleotide 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下载23 份延胡索及其混伪品序列信息，见表2。

表1 市售延胡索样品信息

表2 从GenBank数据库下载的延胡索及其混伪品序列信息

离心柱型植物基因组DNA 提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；ITS2 扩增引物、DNAMarker-D[生工生物工程（上海）股份有限公司]；EB 终结者Green 凝胶核酸染料（南京凯基生物科技发展有限公司）；2×TaqPCR Mix酶（TaKaRa公司）。

1.2 仪器

MM400型混合球磨仪（Resch公司）；Centrifuge 5810/5810 R 型高速离心机（Eppendorf 公司）；MXRL-E 标准型旋转混匀仪[大龙兴创实验仪器（北京）有限公司]；Veriti®型梯度PCR 仪（Life Technoligies公司）；DYY-6C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；TOCAN-360 型全自动凝胶成像系统（上海领成生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 样品DNA提取和PCR扩增

取75%乙醇擦洗过的干净饮片70 mg，平均放入2 个灭菌后的2 mL 离心管中，加入灭菌钢珠，磨碎后采用植物基因组DNA 提取试剂盒提取样品DNA，方法参照说明书。由于药材经过高温炮制后DNA 降解严重，难以扩增出目的片段。为获得高质量的DNA，本实验对试剂盒法提取DNA 进行改良，除将样品质量增加至70 mg 外，在加入提取液之前加入核分离液，以除去蛋白质及酚类物质，加速细胞膜的裂解。同时适当增加水浴时间（56 ℃，过夜），使细胞充分裂解。PCR 反应体系为25 μL，包括2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上游引物ITS2F（5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′）和下游引物ITS3R（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）[13]各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增程序为94 ℃，5 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、45 s，40 个循环；72 ℃，10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，将具有单一明亮目的条带的产物送往美吉生物医药科技有限公司进行双向测序。

2.2 数据处理

应用CodonCode Aligner 软件对测序峰图进行拼接、校对，去除引物及低质量区。基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法，去除两端5.8S和28S区段后获得ITS2 间隔区序列。对所得序列进行美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站的BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）相似性捜索，找出最相似序列进行物种鉴别。利用MEGA 7.0软件进行序列多重比对，查找变异位点，计算鸟嘌呤+胞嘧啶（G+C）占比，比对后的序列基于Kimura 2-parameter（K2P）模型构建邻接（neighbor-joining，NJ）系统发育树，同时NJ 系统发育树各分支的置信度用靴带法做1000次可信度分析。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增结果

市售延胡索饮片共60份利用ITS2引物进行PCR扩增，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物，结果显示约80%（47 份）的样品能够扩增出明显单一、完整的条带（部分凝胶电泳结果见图1）。其中扩增失败的13 份样品可能与其炮制加工方法有关，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版中规定延胡索的加工过程为“置沸水中煮至恰无白心时，取出，晒干”[2]，药材经高温处理后往往会导致DNA严重降解，难以扩增出目的片段。

图1 市售延胡索样品ITS2序列电泳图（1～14号样品）

3.2 基于ITS2序列的物种鉴定

将注释得到的47 条ITS2 序列在中药材DNA 条形码鉴别系统（http://www.tcmbarcode.cn/china/）和GenBank 数据库中进行相似性搜索，完成结果鉴定。以主要单倍型C1（YH8）为例，鉴定结果显示（图2），数据库中与之最匹配的物种为C.yanhusuo，序列描述显示鉴别覆盖率为99%，使用MEGA 6.0软件将其与参考序列KX896711 进行比对分析，结果发现219位A-G变异，延胡索主要单倍型219位为A，数据库中单倍型219 位为G。该结果表明，ITS2序列能够准确鉴定市售延胡索饮片。本次实验所得序列完全符合要求，全部鉴定为正品延胡索。

图2 市售延胡索样品ITS2单倍型C1（YH8）序列与参考序列比对结果

3.3 延胡索药材ITS2序列特征分析

共得到延胡索加工品的ITS2序列47条，长度为238～242 bp，比对后长度为242 bp，C+G 平均占比为70.51%，种内变异较多，主要分布在序列的前半段，共存在17 个变异位点，分别为36、39、42、73位点C-G 变异，44、57 位点G-C 变异，46、70 位点A-G 变异，49 位点T-A 变异，52、55 位点T-A/G 变异，54、197 位点G-A 变异，74 位点T-C 变异。48、58、65 位点为简并碱基。有2 处插入/缺失，分别为35-36、67-68 位点。利用MEGA 6.0 软件进行比对分析，归纳为5 种主要的单倍型（C1～C5），并提交至GenBanK 数据库，登录号为MH260614-18，序列信息见图3。

图3 市售延胡索样品ITS2序列主要单倍型（C1～C5）信息

3.4 NJ系统聚类分析

实验中获得的延胡索ITS2 序列种内变异较大，为进一步确认实验结果的准确性，基于K2P 模型构建了延胡索的5 个单倍型与从GenBank 数据库下载的23条ITS2序列的NJ系统发育树。如图4所示，实验获得的延胡索5 个主要单倍型与数据库下载的延胡索的14 个ITS2 序列单聚为一大支，支持率为95%，而且不同种都能各聚为小枝，能较好地区分；东北延胡索单独聚为一支，支持率为82%，此外，齿瓣延胡索与夏天无聚为一支，支持率为62%，与延胡索和东北延胡索分处不同的分支。NJ 系统发育树表明，延胡索ITS2 序列和参考序列紧密聚合在一起，具有良好的单系性，能够明显区分其混伪品。

图4 延胡索及其混伪品的NJ系统发育树

4 讨论

延胡索具有悠久的用药历史，临床应用广泛，由于地方用药习惯及药材价格的升高，市场上出现了以次充好、掺假等情况，《中国药典》2020 年版仅以延胡索乙素作为单一的检测指标，但目前延胡索的主要混伪品齿瓣延胡索、东北延胡索和夏天无也含有延胡索乙素，且东北延胡索和齿瓣延胡索均有一定的毒性[14]，因此有必要对市售延胡索饮片进行鉴定，避免药材混用、误用的情况。

传统的中药鉴别方法主要为性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别，其中性状鉴别容易受主观因素的影响，显微和理化鉴别需对样品进行复杂的前处理，耗时耗力[15]，随着现代分子生物学的发展，逐渐将分子生物技术应用到药用植物的鉴别中，该方法主要是依据药材的DNA 差异来完成对药材的鉴别，已有研究将DNA 条形码技术用于延胡索及其混伪品的鉴别，通常以延胡索新鲜块茎为研究对象，但市售延胡索药材都是经过高温蒸煮或醋炙等的加工品，其DNA 降解严重，PCR 扩增困难，不利于进行分子生物鉴别。本研究以延胡索炮制加工品为研究对象，以ITS2 作为DNA 条形码成功扩增出完整、符合要求且变异位点丰富的序列。除此之外，基于ITS2 条形码序列构建的NJ系统发育树显示，延胡索加工品与其混伪品分属于不同的分支，而同一物种紧密的聚集在一起，表明ITS2 条形码序列能够准确鉴别延胡索加工品及其混伪品，验证了ITS2 条形码的鉴别能力，可以为保障延胡索的临床安全合理应用提供依据。