基于血清药物化学和网络药理学的厚朴“下气除满”药效物质基础和作用机制研究△

荆文光，赵小亮，常潞，程显隆，马双成*，魏锋*

1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.中国中医科学院 医学实验中心，北京 100700；3.中国药科大学 中药学院，江苏 南京 211198

厚朴Magnoliae Officinalis Cortex 为临床常见理气药，始载于《神农本草经》，来源于木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹叶厚朴M.offcinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮[1]。现代药理研究表明，厚朴具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用；其中促进胃肠动力与其传统燥湿消痰、下气除满的功效相符合，临床上用于慢性腹泻、便秘、肠梗阻、急慢性胃炎、胃轻瘫、胃十二指肠溃疡等疾病[2]。现代化学成分研究表明，厚朴酚、和厚朴酚是厚朴的主要药效物质[3-4]，具有抗氧化、神经营养及保护、抗肿瘤等活性[5-9]。厚朴传统入药多为水煎剂，对其水溶性成分的研究陆续兴起，诸多苯乙醇苷类、生物碱类化合物被发现[10-13]，这些成分是否也为药效成分，或者是否与脂溶性的厚朴酚、和厚朴酚起到协同增效作用都值得深入研究。

网络药理学是建立在疾病-基因-药物的多层次网络基础上，运用系统生物学、网络生物学及网络平衡的整体观等理解药物和机体相互作用，阐述疾病发展的过程，其多基因、多靶点的特点与中医药系统观、整体观的治疗理念相一致，在中药研究中已得到广泛应用[14]。血清药物化学研究认为药物口服吸收后只有移行入血的成分才可能是发挥药效的成分，通过高分辨质谱等技术对含药血清中的原型成分及其代谢产物进行分析，快速、准确地阐明中药发挥药效的物质基础，并采用生物活性高通量筛选、疾病动物模型、计算机辅助药物设计和虚拟筛选等技术对移行成分进行验证[15-16]。多数文献中网络药理学研究指标均以各数据库中收集的化学成分及其口服生物利用度为筛选条件，然而传统中药多为复方水煎剂，部分药材中的化学成分未能转移到汤剂中，或者在多种成分的协同作用下，部分化学成分的生物利用度发生改变，网络药理学预测结果可能存在偏差。血清药物化学与网络药理学的紧密结合不仅可以通过分析药物入血成分，寻找体内直接作用物质，同时利用入血成分构建相关药理网络，更能直接反映其药理作用机制。

胃轻瘫综合征（gastroparesis syndrome）是指以胃排空延缓为特征的临床症状群，中医辨证属痞满范畴，而厚朴具有“下气除满”的功效，故本研究选取胃轻瘫作为候选疾病，筛选疾病靶点。通过液相色谱-质谱法对厚朴水煎液和入血成分等进行分析，结合网络药理学探讨入血成分发挥功效的作用机制，为进一步阐明厚朴汤剂药效物质基础及深入研究厚朴的质量标志物提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Forma 88000型-86 ℃超低温冰箱（美国Thermo Scientific 公司）；Rotanta 460R 型高速冷冻离心机（德国Hetich公司）；ABS2TM 型自动采血仪及ABS2软件（美国Instech Laboratories 公司）；小动物自由活动装置（医学实验中心自制）；CBAS-C30 型肝素化采血管（美国Solomon Scientific 公司）；1200-6320 Ion Trap XCT 型液相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）。

1.2 试药

厚朴药材采自湖北恩施市华中药用植物园，经中国食品药品检定研究院魏锋研究员鉴定为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥干皮。

肝素钠（批号：20120612）、水合氯醛（批号：20130201）均购于国药集团化学试剂有限公司；氯化钠注射液（批号：A17022005，河北天成药业股份有限公司）；对照品紫丁香酚苷（批号：Y28M9H57297）、木兰箭毒碱（批号：M29J8S40878）、咖啡酸（批号：W16O10B100366）、巴婆碱（批号：J21）、咖啡酸甲酯（批号：D30N10G104165）、木兰花碱（批号：R21M9F61834）、番荔枝碱（批号：O24）、木兰苷A（批号：X16S8L44141）、厚朴酚（批号：KS0912CB14）、和厚朴酚（批号：T28O6B5149）、β-桉叶醇（批号：P24O8F46474）均购自上海源叶生物科技有限公司，经超高效液相色谱法（UPLC）峰面积归一化法测定，纯度均大于98.0%；对照品木兰苷B、木兰苷D、辣薄荷基厚朴酚为实验室自制，经UPLC 峰面积归一化法测定，纯度均大于98.0%。

1.3 实验动物

雄性SD 大鼠12 只，SPF 级，7～8 周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。大鼠饲养于IVC 笼具（独立通气笼，461 mm×274 mm×229 mm，意大利Tecniplast公司），每笼3只，保持实验室环境温度为22 ℃，相对湿度为50%左右。

2 方法

2.1 厚朴水煎液入血成分分析

2.1.1色谱和质谱条件 Agilent Extend-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，5%B；5～20 min，5%～20%B；20～30 min，20%～28%B；30～42 min，28%～74%B；42～55 min，74%～80%B；55～60 min，80%～90%B；60～70 min，90%B）；流速1.0 mL·min-1，柱后4∶1 分流，进质谱的流速为0.2 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样体积为10 μL。使用电喷雾离子源（ESI）进行负离子模式全扫描；碰撞气为氦气；雾化气压力为50 psi（1 psi≈6895 Pa）；干燥气体流速为10.0 L·min-1；干燥气温度为350 ℃；毛细管电压为4000 V；扫描范围为m/z50～1000。

2.1.2厚朴水煎液样品制备 取厚朴药材100 g，粉碎至粗粉，加水800 mL，煎煮2 次，每次2 h，合并水煎液，减压浓缩至1 g·mL-1（以生药量计）。

2.1.3动物分组与给药 SD 大鼠6 只，随机分为2 组，对照组、厚朴给药组各3 只。实验前禁食12 h，全程自由饮水，给药组按3.3 g·kg-1（以生药量计，相当于人体给药剂量20 倍）给药3 d，每天2次。

2.1.4血浆采集与制备 大鼠称体质量后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（按大鼠体质量350 mg·kg-1给药），颈部和背部剃毛（2 cm×2 cm）。仰卧位固定，右侧颈部近锁骨位置碘酒消毒，75%乙醇脱碘，然后切开长约1.5 cm 小口，钝性分离结缔组织和肌肉，使颈总静脉暴露于视野下，然后剪一小口，小心插入肝素化的采血管，结扎。将采血管从大鼠背部引出，并与大鼠采血马甲连接，IVC 笼具单笼饲养，过夜。大鼠实验前禁食12～16 h，自由饮水。给药后4 h正常饮食。选取能顺利抽血，无过敏、发炎等不良反应的大鼠进行药动学的采血实验。在末次给药后不同的时间点（0、10、20、30、45 min 及1.0、1.5、2.0、2.5、4.0 h）采集血液样品，采血体积为350 μL，采血速度为375 μL·min-1，补液速度为375 μL·min-1，保持“低漏失”模式，补肝素化0.9%氯化钠溶液速度：100 μL·h-1，样品收集室温度为4～6 ℃。实验组同一时间点每只大鼠取血浆100 μL，混合为300 μL，加入3 倍甲醇沉淀，涡旋3 min，12 000 r·min-1离心10 min（离心半径为8 cm），氮气吹干，50%甲醇100 μL复溶，重复离心10 min，取上清液进样。对照组大鼠取血浆300 μL，步骤同上，取上清液进样。

2.1.5尿液、粪便采集与制备 SD 大鼠6 只，分组与给药同2.1.3项下。第4天置于代谢笼中，禁食12 h，自由饮水，于6、12、24 h 收集尿液和粪便。记录各时间点收集到的尿液体积和粪便质量，分别置于离心管中，-80 ℃保存。实验组同一时间点取每只大鼠尿液收集量的1%，混合，3 倍甲醇沉淀，涡旋3 min，12 000 r·min-1离心10 min（离心半径为8 cm），取上清液进样。对照组大鼠取样100 μL，步骤同上，取上清液进样。实验组大鼠同一时间点取每只大鼠粪便收集量的10%，混合，用20 倍70%甲醇提取（涡旋3 min，超声30 min），按上述同样离心条件离心10 min，取上清液进样。对照组大鼠取样50 mg，步骤同上，取上清液进样。

2.2 网络药理学研究

2.2.1厚朴潜在靶点预测 将分析得到的厚朴水煎剂入血成分通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）2.3、STITCH 5.0、SwissTargetPrediction、SuperPred 数据库获取相关靶蛋白，利用UniProt 数据库对入血成分靶点蛋白进行匹配分析，并转化成gene symbol。

2.2.2构建胃轻瘫疾病靶点数据库 利用TTD、DiGSeE 2.01、OMIM、DrugBank 5.1.0、HPO 数据库，以“gastroparesis”为关键词，检索与胃轻瘫相关的基因，构建胃轻瘫疾病靶点数据库。

2.2.3蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建 将药物和疾病靶点输入STRING 10.5 数据库，限定物种为人类（Homo sapiens），构建药物、胃轻瘫靶点PPI 网络。通过Cytoscape 3.5.1 对药物、胃轻瘫靶点数据取交集，寻找核心靶点，并绘制出药物-入血成分-靶点PPI网络。

2.2.4基因本体（GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 利用DAVID 6.7 数据库对入血成分、疾病交集靶点蛋白进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，其中Select Identifier 设置为Official Gene Symbol，List Type 设置为Gene List，限定物种为人，列出-lgP排名前20的通路。

3 结果

3.1 厚朴水煎剂化学成分分析

厚朴水煎剂化学成分总离子流图（TIC）见图1，根据部分对照品保留时间和质谱数据，结合质谱裂解规律，从厚朴水煎剂中共鉴定出54 个化合物（表1），主要为苯乙醇苷、生物碱和木脂素类成分。

图1 厚朴水煎剂负、正离子模式下的TIC图

表1 厚朴水煎剂中化学成分

续表1

续表1

3.2 大鼠血清中成分分析与鉴定

对不同采血时间点大鼠血清中成分进行分析，结果表明，给药后1 h 的血清样品中移行成分最多，且各成分色谱峰响应值较高，因此选定1 h为最佳采血时间。通过各成分的保留时间、质谱裂解规律及文献参考，推测厚朴水煎剂入血成分。对比空白血清，含药血清中发现14 个移行成分，包括厚朴酚、和厚朴酚等木脂素类脂溶性成分，木兰花碱、木兰箭毒碱等生物碱类成分和其他如谷甾醇、桉叶醇类成分等（表2）。

表2 大鼠血清中成分鉴定

3.3 尿液和粪便成分的分析

分析大鼠尿液和粪便，结果显示，尿液中大部分为入血的原型成分，粪便中多为苯乙醇苷类、酚苷类等成分（表3），推测该类未被肠道吸收的原型成分主要通过粪便排出体外。

表3 大鼠尿液和粪便中成分鉴定

3.4 厚朴入血成分靶点筛选

将入血成分输入到TCMSP 2.3、STITCH 5.0、SwissTargetPrediction 和SuperPred 数据库进行检索，结果共有7 个入血成分筛选到靶点，收集得到的靶点并删除重复靶点，整理共得到118 个靶点，见表4。同时利用Cytoscape 3.5.1 构建厚朴药材、入血成分和相关靶点的网络关系图（图2）。

图2 厚朴的药物-入血成分-靶点网络

表4 厚朴主要入血成分靶点

3.5 胃轻瘫靶点筛选

利用TTD、DiGSeE 2.01、OMIM、DrugBank、HPO 数据库并结合文献[27-33]，检索胃轻瘫疾病靶点，经整理合并后共得到55个靶点（表5）。

表5 胃轻瘫疾病靶点

3.6 PPI网络构建

通过STRING 10.5 对药物、胃轻瘫靶点构建PPI 网络。药物靶点PPI 网络得到607 个节点和7252条边；胃轻瘫靶点PPI 网络得到547 个节点和9171条边，平均节点度值为6.23。通过Cytoscape 3.5.1对药物、胃轻瘫PPI数据取交集，结果得到124个节点（图3），可以看出人激肽原1（KNG1）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α（PIK3CA）、表皮生长因子（EGF）、内皮型一氧化氮合酶3（NOS3）、血管内皮生长因子A（VEGFA）等为PPI核心靶点。

图3 厚朴治疗胃轻瘫靶点的PPI网络

3.7 GO功能富集分析和KEGG通路分析

利用DAVID 6.7 平台对药物疾病交集的核心靶点进行GO 富集分析及KEGG 通路富集分析。GO 富集分析包括分子功能、细胞组分、生物学过程分析，分子功能主要涉及细胞信号转导、血小板脱颗粒及RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等方面；细胞组分主要涉及血小板α颗粒腔体、细胞质膜、胞外区等方面；生物学过程主要涉及血小板脱颗粒、细胞外信号调节激酶1（ERK1）和ERK2 的正向调节、对药物的反应等方面。以-lgP值进行排名并列出排名前15 的途径，见图4。对富集得到的通路结果，以-lgP及各通路连接的基因数从大到小进行排序，见图5。结果表明，厚朴中有效成分可能通过催乳素信号通路、雌激素信号通路、RAS 信号通路及神经营养因子信号通路等发挥胃肠推动作用。

图4 厚朴入血成分与胃轻瘫疾病交集核心靶点GO富集分析

图5 厚朴入血成分与胃轻瘫疾病交集核心靶点KEGG通路富集分析

4 讨论

化学成分研究表明，厚朴中除含有厚朴酚类成分外，还含有多种苯乙醇苷类化学成分，从本实验中大鼠的尿液和粪便中均能检出，推测这些化合物很难被吸收。李玲等[34]通过研究苯乙醇苷类化合物木兰苷A 在大鼠体内的药动学发现，此类化合物具有吸收快、消除迅速且生物利用度低的特点，口服给药后在大鼠尿液和粪便中检测到的苯乙醇苷类化合物多丢失1 个咖啡酰基得到m/z461 [M-HC9H6O3]-，或者失去1 个脱氧六碳糖基得到只连1 个葡萄糖基的苯乙醇苷部分m/z315[M-H-C9H6O3-C6H10O4]-，此后该部分裂解为丢失葡萄糖基的苷元和1 分子水后形成的脱氢离子m/z135 [M-HC9H6O3-C6H10O4-C6H12O6]-，与苯乙醇苷类化合物的裂解方式一致，下一步将根据每种化学成分的裂解规律开展代谢产物研究。

厚朴具有燥湿消痰、下气除满的功效，为消除胀满的要药。而胃轻瘫综合征是指以胃排空延缓为特征的临床症状群，主要表现为早饱、餐后上腹饱胀、恶心、发作性干呕、呕吐、体质量减轻等，又称胃麻痹、胃无力等。胃轻瘫综合征不仅发生在胃手术后，还可见于其他腹部手术后和代谢疾病中，是一种影响胃功能的潜在严重疾病，如糖尿病胃轻瘫（DGP）是糖尿病患者最常见的消化道并发症，以非机械性梗阻所致的胃排空延迟为主要特点[35]。胃排空过程受神经、激素、血糖等多系统、多因素调节，这些组织学变化及相关调控因素的改变与DGP 的发生和发展密切相关。核心靶点KNG1 是硫醇蛋白酶的抑制剂，高分子量激肽原（HMWK）释放的活性肽缓激肽能影响平滑肌收缩，降低血液中葡萄糖水平[36]；PI3K 的激活在质膜上产生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3 通过将含有PH 结构域的蛋白质[包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（Akt1）和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDPK1）]募集到膜上而发挥关键作用，激活参与细胞生长、存活、增殖、运动和形态的信号级联通路，并在受体酪氨酸激酶配体如EGF、胰岛素样生长因子1（IGF1）、VEGFA 和血小板衍生生长因子（PDGF）的刺激下参与Akt1 的激活，通过胰岛素受体底物（IRS）蛋白参与信号传导[37]。VEGFA 是在血管生成和内皮细胞生长中具有活性的生长因子，能够诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制细胞凋亡并诱导血管通透化[38]。NOS3 能够产生一氧化氮（NO），NO作为一种抑制性神经递质，可引起胃底容受性和幽门松弛，在DGP 的发病中起到重要作用[39]。黄颖秋等[40]证实NO 作为一种新型的非肾上腺非胆碱能（NANC）神经递质，可能参与胃排空的调节，NO增多引起括约肌松弛，反之，括约肌收缩。DGP 患者神经细胞内NO 水平显著增高，且随DGP 病程的延长和血糖的升高而进行性增加[27-28]，而核心靶点NOS3能参与调节一氧化氮合酶的活性。

Thomas 等[29]认为p38MAPK 通路的激活可以加快雌激素受体（ER）的转运速度及其与雌激素反应元件（EREs）的结合，从而证明雌激素对胃排空有重要的作用。这与研究发现胃轻瘫患者以女性居多，男女比例约为1∶4，且女性患者的症状会随雌激素水平的变化而变化相符合，由此推测雌激素会影响DGP 患者胃排空进程[30-31]。此 外，Gonenne 等[32]研究表明，雌激素可使胃排空时间延长，但胃肠传输时间不受影响。有研究表明，雌二醇可刺激胃肠道非肾上腺素非胆碱能神经释放NO，从而减慢胃排空[33]。雌激素信号通路上有厚朴与胃轻瘫疾病的共同靶点NOS3，因此推测厚朴可能通过调节雌激素信号通路改善胃排空。有研究表明，厚朴提取物及厚朴酚可提高小鼠胃排空率及小肠推进率，其对胃肠动力的促进作用可能与兴奋M 胆碱受体和调节5-羟色胺3（5-HT3）有关[41]。而张卫卫[42]研究结果显示，厚朴酚与和厚朴酚可以抑制乙酰胆碱（ACH）、5-HT 所致的大鼠离体胃底条的收缩，使胃肠平滑肌松弛。此外，厚朴酚与和厚朴酚作为非竞争性毒蕈碱拮抗剂，两者均能抑制ACH 诱导的平滑肌收缩和ACH 诱导的细胞外Ca2+依赖性收缩[41,43-46]，其改善胃排空和肠推进功能的作用可能与胃肠平滑肌松弛功能有关。

综上所述，本研究基于血清药物化学与网络药理学，在体内化学成分分析辨识的基础上通过关联网络构建及分析，初步阐释了厚朴“下气除满”的作用机制，可为厚朴质量标志物的研究和相关药效物质的作用机制探究提供一定参考。