太空搭载膜荚黄芪SP2代2年生群体遗传变异分析△

陈永中，陈垣，郭凤霞，董林林，刘兰兰，孙亚鹏，许宏亮，李红玲

1.甘肃农业大学 农学院/生命科学技术学院/甘肃省中药材规范化生产技术创新重点实验室/甘肃省药用植物栽培育种工程研究中心/甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；3.天津市现代中药资源研究企业重点实验室/天津天士力现代中药资源有限公司，天津 300410

膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.是豆科（Leguminosae）黄芪属（Astragalus）多年生草本植物，主产于黑龙江、吉林、内蒙古、甘肃、山西等地，以根入药，味甘，性温，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功效，用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、表虚自汗、内热消渴等[1]。黄芪种类较多，栽培中存在品种混杂、种质退化等问题，有必要选育膜荚黄芪新品种以提高其质量和产量。

然而，随着黄芪用量增大，野生资源减少，生产中严重缺乏矮秆、根型优异、丰产优质的品种。航天育种指利用返回式飞行器搭载种子，使其经历太空环境，促进其诱变，培育新种质和选育新品种的现代育种技术[2-3]，具有种质变异幅度大、优良变异多和育种周期短等优点[4]，在基因型复杂的中药材育种方面应用潜力巨大[5-7]。例如，曹丽等[8]研究发现空间环境诱导植株中控制株高相关基因的改变，致矮秆突变株的茎秆由上至下发生不同程度节间长度缩短，育成矮秆突变株系DMR88-1。简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）是由1～6 个核苷酸组成的串联重复基元，分布于真核生物基因组，具有多态性丰富、分辨率高、遗传信息量大、标记显性、稳定性高、检测成本低廉等优点，是一种重要的辅助育种手段，被广泛用于构建植物遗传图谱、基因组比较作图和遗传多样性研究等[9]。张利民等[10]在分析蒙古黄芪转录组序列中的SSR 位点时发现，引物CL609 在10 份膜荚黄芪样品中均能扩增出约700 bp的特异条带，而蒙古黄芪无此条带，说明该引物可区分蒙古黄芪和膜荚黄芪。SSR 分子标记技术已被应用到多种作物遗传多样性研究[11-14]，但对利用太空诱变获得的膜荚黄芪变异世代遗传多样性研究尚无报道。随着大健康中药产业的发展，中药材生态有机栽培将全面推行，有必要选育适宜生态有机栽培的膜荚黄芪优良新品种。因此，本研究在有机栽培条件下，从形态学和分子生物学角度对不同太空搭载方式种子建立的膜荚黄芪SP2代2 年生群体的变异性进行深入分析，以期揭示太空搭载方式对膜荚黄芪遗传多样性的诱导效应。

1 材料

1.1 样品

膜荚黄芪种子由天津天士力现代中药资源有限公司联系国家航天管理局搭载，经甘肃农业大学陈垣教授鉴定为膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.种子。根据搭载要求，将种子分成3份，一份留作地面对照（CK），一份（100 g）搭载“神舟十一号”太空运行33 d，编号为航芪33 d（以下简称33 d），一份（20 g）搭载“长征七号”，太空运行22 h，编号为航芪22 h（以下简称22 h）。种子返回地面后封装于牛皮纸袋，4 ℃冰箱干燥保存，在相同时间播种育苗。

1.2 仪器

YM-48 型多样品组织研磨机（上海豫明仪器有限公司）；ND2000 型紫外-可见分光光度计（美国Thermo Scientific公司）；Applied Biosystems™2720型热循环仪（赛默飞世尔科技有限公司）；DYY-8C 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；JY04S 型凝胶成像系统（北京君意东方电泳设备有限公司）。

1.3 试药

三氯甲烷（批号：20191111）、无水乙醇（批号：20210118）均购于国药集团化学试剂有限公司；植物基因组DNA 提取试剂盒（批号：2101#07，北京华越洋生物科技有限公司）；DL 1000 DNA Marker（批号：AJF1737A，北京依托华茂生物科技有限公司）；金牌Mix（green）聚合酶（批号：OBH21702）、绿色荧光核酸染料（批号：20201109）、西班牙琼脂糖（Biowest Agarose）G-10（批号：111860）均购于北京擎科新业生物技术有限公司。

2 方法

2.1 试验地概况

试验地位于甘肃省陇西县巩昌镇园艺村，坐标为E104°37′31.07″、N35°1′3.28″，海拔1767 m，年降水量约为415 mm，平均温度8.1 ℃，日照时数为2210 h，无霜期160 d。该地为黄芪道地产区，属黄土高原地区，土壤为黄绵土，土质肥沃疏松，气候为温带大陆性季风气候。

2.2 SP2代种子来源及2年生群体的建立

诱变种子于2017 年4 月22 日条播育苗，在2018年成药期采种获得SP2代种子。2019 年4 月20 日，用SP2代种子育苗，于11 月5 日移栽，2020 年春季返青后得到SP2代2年生群体。

2.3 表型性状的遗传多样性分析

按照《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 黄芪》NY/T 2592—2014 规定[15]进行表型性状调查。在CK 群体、诱变33 d 群体和诱变22 h 群体的选种圃中各随机选取具有明显表型性状的植株50 株，测量表型性状指标。数量性状包括株高、株幅、茎粗、一级分枝数、二级分枝数、复叶数、小叶数、叶长、叶宽；质量性状包括茸毛、叶毛、茎色、叶色、花色、叶尖、荚色、荚形。剪取植株上部健康叶片，硅胶干燥后，保存于-20 ℃备用。

2.4 SSR分子标记的遗传多样性分析

2.4.1基因组DNA 提取与检测 精确称取叶片30 mg，多样品组织研磨机研磨后，采用植物基因组DNA 提取试剂盒提取，通过紫外-可见分光光度计检测提取所得DNA浓度，保存-20 ℃冰箱中备用。

2.4.2引物筛选与聚合酶链式反应（PCR）扩增 查阅文献，收集可用于黄芪遗传分析的SSR 引物15 对[16-18]，由睿博兴科生物技术有限公司合成。依据表型性状测量结果，从3 个群体中各选取株高、株幅、茎粗、一级分枝数、二级分枝数、复叶数、茸毛、茎色、叶色、花色差异较大的10 份样品，进行引物筛选，最终确定稳定性、多态性、重复性好且带型清晰的8 对引物用于本研究（表1）。采用热循环仪对黄芪基因组进行扩增，扩增程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s；43～58 ℃（温度随引物而定），退火15 s；72 ℃延伸15 s，共35～45 个循环（随引物退火温度不同而定），72 ℃后延伸5 min，4 ℃保存。反应体系：20 μL 体系1.1× Golden T6 Super PCR Mix 10 μL、100 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL、DNA 模板1 μL、去离子水7 μL。扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶，210 V 电压下电泳分离35 min，凝胶成像系统观察拍照。

表1 黄芪8对引物的扩增结果及多态性信息

2.5 数据统计

对3 个群体各50 份表型描述资料数据进行数值转化处理（表2），遗传多样性指数（H′）采用Shannon-Weaver 多样性指数。采用Excel 2003 以参考文献[19]所列公式计算H′，使用SPSS 21.0 将表型数据标准正态转换，采用组间连接法聚类，以欧式距离绘制树状聚类图。根据SSR-PCR 扩增产物的电泳图，人工选取长度为100～1000 bp、清晰可辨的扩增条带统计，对于同一引物的扩增产物，按同一DNA 条带的有无统计，电泳结果读带采取0/1方式，构建分子标记结果的数据矩阵，按参考文献[17]计算引物PIC，用PopGen32 软件计算有带、无带所占的频率，利用NTSYS-pc2.10e软件计算参试样品的遗传距离（GD）和遗传相似系数（GS），基于GS，用非加权配对算术平均法（UPGMA）构建亲缘关系聚类树状图[17]。

表2 膜荚黄芪质量性状及其赋值

3 结果

3.1 基于表型性状的遗传多样性分析

3.1.1变异分析与H′分析 33 d、22 h 和CK 3 个群体各50份膜荚黄芪材料的17个表型性状的变异系数（CV）和H′见表3。33 d、22 h 和CK 群体的平均CV 分别为29.37%、26.17%和26.10%；平均H′分别 为1.27、1.22 和1.24。从CV 和H′结果可知，33 d群体的平均CV和平均H′均高于22 h 和CK 群体，除复叶数外，CV 和H′的最大值与最小值在3 个群体中对应的表型性状不一致。

表3 膜荚黄芪三群体试验材料不同表型性状变异分析

3.1.2表型聚类分析 由图1 可知，在欧氏距离为5 处，33 d、22 h 和CK 群体各50 份黄芪样品分别聚为五大类群、六大类群和三大类群。33 d 群体的第Ⅰ类群包含14 份材料，该类群叶色以绿色为主，浅绿色次之，叶片较细长，上表面有茸毛，花瓣前端多披紫色，株型紧凑，株高适中，株幅较小，分枝较多，复叶数较浓密；第Ⅱ类群包含15 份材料，该类群叶色以绿色为主，叶片细长，上表面有茸毛，花瓣前部披紫色为主，花瓣黄白色次之，株型松散，植株高，株幅较宽，分枝较多，茎秆较大；第Ⅲ类群包含13 份材料，该类群茎色全为半紫色，叶片较细长，花瓣黄白色为主，株型紧凑，株高适中，株幅适中，分枝多，复叶浓密，茎秆粗大；第Ⅳ类群包含7 份材料，该类群茎色以半紫色为主，植株高而紧凑，分枝少，复叶稀疏，小叶多而细长，茎秆较细；第Ⅴ类群仅包含1 份材料，植株矮小，分枝少，复叶稀疏，小叶多而细长，茎秆绿而细。22 h 群体的第Ⅰ类群包含13 份材料，该类群叶色以绿色为主，深绿色次之，叶片细长，上表面有茸毛，顶端圆，花瓣前端披紫色为主，植株高而紧凑，分枝多，复叶浓密，茎秆粗大；第Ⅱ类群包含20 份材料，该类群叶色以绿色为主，深绿色次之，叶片细长，上表面有茸毛，花瓣前端披紫色为主，花瓣黄白色次之，植株高而紧凑，分枝较多，复叶较浓密，茎秆较大；第Ⅲ类群包含4 份材料，该类群花瓣黄白色，叶片细长，上表面有茸毛顶端圆，植株高而松散，分枝较多，复叶稀疏；第Ⅳ类群包含10 份材料，该类群叶色以绿色为主，花瓣尖部披紫色为主，植株高而紧凑，分枝较少，复叶稀疏，茎秆较粗；第Ⅴ类群仅包含1 份材料，植株高大而松散，叶色浅绿，花瓣前部披紫色，分枝较少，复叶稀疏，茎秆较粗；第Ⅵ类群仅包含2 份材料，植株矮而松散，叶色绿，叶片细长，分枝较少，复叶稀疏，茎秆较细。CK 群体的第Ⅰ类群包含22份材料，该类群叶色以绿色为主，浅绿色次之，叶片较宽长，上表面有茸毛，花瓣前部多披紫色，株型紧凑，分枝较多，复叶浓密，茎秆粗大；第Ⅱ类群包含19 份材料，该类群叶色以绿色为主，叶片短小上表面有茸毛，花瓣前部披紫色为主，花瓣黄白色次之，株型松散，植株较高大，分枝较多，茎秆较大；第Ⅲ类群包含9 份材料，该类群叶色以绿色为主，叶片较细长，花瓣黄白色为主，株型高大，分枝较少，复叶稀疏，茎秆较细。可见，在欧氏距离为5处，诱变后群体聚集的类群比CK 群体多，且33 d 群体聚集的类群较22 h 群体少，各类群表型性状不一致，说明诱变后群体具有较为丰富的遗传多样性，但22 h 群体遗传多样性高于33 d群体。

图1 膜荚黄芪33 d、22 h和CK群体表型性状聚类结果

3.2 基于SSR分子标记的遗传多样性分析

3.2.1多态性分析 采用8 对引物对三群体的各50份材料进行PCR 扩增，产物分布在100～1000 bp，三群体均扩增出21 个清晰度较高、重复性较好的电泳条带（表1、图2），平均每对引物可扩增出2.63个条带。其中，多态性条带共扩增出38 个，有5 对引物的扩增条带多态性比率为100%，平均每对引物的PIC 在33 d、22 h 和CK群体中分别为0.320、0.427 和0.333，多态信息含量可以较好地衡量SSR分子标记位点多态性的高低，当PIC＜0.25 时，具有低度多态性，当0.25≤PIC＜0.50 时，具有中度多态性，当PIC≥0.50 时，具有高度多态性[20]，扩增结果表明，22 h群体多态性高于33 d和CK群体，供试材料遗传多样性较为丰富。

图2 引物Y11在膜荚黄芪样品中的扩增结果

3.2.2GD和GS分析 对33 d、22 h 和CK 群体的GD和GS进行统计。结果显示，GD分别为0～0.895 9、0.027 0～0.943 5和0～0.895 9，GS分别为0.400 0～1.000 0、0.384 6～0.973 0 和0.400 0～1.000 0。33 d 群体GS最小的是2 号与25 号植株、2 号和32 号植株，GS均为0.400 0；GS最大是23号与24号植株，GS为1.000 0。22 h群体GS最小的是6号与44号植株，GS为0.384 6，GS最大的是11 号与14 号植株，GS为0.973 0。CK群体GS最小的是1号与24号植株，GS为0.400 0，GS最大的是41号与46号植株，GS为1.000 0。可见，33 d和CK群体的GD和GS一样，但对应植株材料不一致，2 个群体的GD和GS稍大于22 h 群体，说明33 d和CK群体中有的植株与群体其他植株间差异较大，且三群体的SSR位点均具有较高遗传多样性。

3.2.3SSR 分子标记聚类分析 由图3 可知，在GS为0.68 处，可把33 d、22 h 和CK 群体材料分成4、5 和4 个类群。33 d 群体的第Ⅰ类群包含10 份材料，该类群叶色以绿色为主，叶片较细长，上表面有茸毛，花瓣前端多披紫色，株高适中，株幅较大，分枝较多，复叶稀疏，茎秆较细小；第Ⅱ类群包含22份材料，该类群叶色以绿色为主，浅绿色次之，叶片细长，花瓣前端披紫色为主，花瓣黄白色次之，株型紧凑，株高最高，株幅较窄，分枝较少，茎秆较细小；第Ⅲ类群包含8 份材料，该类群叶色以绿色为主，叶片细长，上表面有茸毛，茎色多为半紫色，花瓣黄白色与花瓣前端多披紫色植株各占1/2，植株高而宽大，多分枝，复叶浓密，茎秆粗大；第Ⅳ类群包含10 份材料，该类群叶色以浅绿色为主，叶片细长，上表面多有茸毛顶端圆，茎色全为半紫色，植株高而紧凑，分枝较多，复叶稀疏，小叶细长；22 h 群体的第Ⅰ类群包含8 份材料，该类群叶色绿和深绿色植株各占1/2，叶片细长，上表面有茸毛顶端圆，花瓣前端披紫色为主，植株高而宽大，分枝较多，复叶浓密，茎秆粗大；第Ⅱ类群仅包含2 份材料，该类群叶片较细长，上表面有茸毛顶端圆，花瓣黄白色，植株高度适中而宽大，分枝较少，复叶浓密，茎秆较细；第Ⅲ类群包含30 份材料，该类群叶色以绿色为主，叶片细长，上表面有茸毛，茎色多为半紫色，植株高而宽大，分枝较多，复叶稀疏，茎秆较大；第Ⅳ类群包含9 份材料，该类群叶色以绿色为主，叶片较细长，上表面有茸毛，花瓣前端披紫色为主，植株高而较窄，多分枝，复叶较稀疏，茎秆较粗；第Ⅴ类群仅包含1 份材料，植株高而松散，叶色绿而细长，花瓣前端披紫色，多分枝，复叶稀疏，茎秆较粗，半紫茎。CK群体的第Ⅰ类群仅包含2 份材料，该类群叶片较细长，上表面有茸毛顶端尖，植株高大，多分枝，复叶浓密，茎秆粗大；第Ⅱ类群包含4 份材料，该类群叶色绿，叶片细长，上表面有茸毛顶端尖，植株高大，多分枝，复叶稀疏，茎秆粗大；第Ⅲ类群包含30 份材料，该类群叶色以绿色为主，浅绿色次之，叶片细长，上表面有茸毛顶端尖，茎色多为半紫色，植株高而较窄，多分枝，复叶较稀疏，茎秆较细；第Ⅳ类群包含14 份材料，该类群叶色以绿色为主，浅绿色次之，叶片较细长，上表面、顶端尖为主，花瓣前端披紫色为主，披黄白色次之，茎色多为半紫色，植株较低矮而宽大，分枝较少，复叶较浓密，茎秆粗大。综上所述，在GS为0.68 处，33 d 和CK 群体较22 h 群体少一类群，三群体之间各类群表型性状区别较为明显，说明各群体都具有较为丰富的遗传多样性，但22 h群体遗传多样性仍高于另2个群体。

图3 膜荚黄芪群体SSR分子标记的UPGMA聚类图

4 讨论

4.1 基于表型性状分析航天搭载诱变的膜荚黄芪SP2代群体遗传多样性

膜荚黄芪人工栽培第1年育苗，第2年成药。种质资源遗传多样性主要指群体内个体间基因组成的差异，是多基因组合表达的结果，在同一植物不同品种甚至不同个体间表型性状也会出现不同程度的差异，其高低直接影响品种改良的效果，新品种选育有赖于优良基因的发现和利用[21]。本研究通过对航天搭载诱变33 d和22 h的膜荚黄芪种子建立的SP2代2年生群体及CK 表型性状的变异度和遗传多样性分析，发现诱变后的2个群体表型性状的CV 和H′高低次序不完全一致。33 d群体复叶数、一级分枝数、花色、荚形多样性较丰富，22 h 群体多样性较丰富的指标是二级分枝数、茎粗和叶长，而CK 的茎粗、叶长和一级分枝数较丰富；这与谢向誉等[22]对48 份广西地方核心食用木薯种质资源的41 个表型性状CV和多样性指数分析的结果一致。本研究聚类分析在欧氏距离为5 处把33 d、22 h 和CK 群体分别聚为5 个、6 个和3 个类群，33 d 较22 h 少1 个类群，说明诱变后的33 d 和22 h 群体较CK 具有更为丰富的遗传多样性，22 h 群体遗传多样性高于33 d 群体，田间试验也观察到22 h 群体在返青期个体间形态差异性更大。

4.2 基于分子标记分析航天搭载诱变的膜荚黄芪SP2代群体遗传多样性

SSR 分子标记具有多态性丰富、遗传信息量大等优点[8]，已应用到黄芪鉴定中。孙会改等[23]采用流式细胞术和K-mer 分析估测黄芪基因组大小，为其全基因组测序研究提供了参考数据。常越等[24]利用MISA 工具筛选膜荚黄芪转录组测序获得的9893 条unigenes，对其SSR 位点信息分析搜索到1729 个SSR 位点，SSR 的发生频率为9.24%，SSR 在黄芪整个转录组中出现的频率为13.42%，平均距离为7.97 kb。对甘肃6 个主栽区57 份黄芪样本利用SSR标记遗传多样性分析发现，PCR 产物长度为100～1000 bp，多态性位点82个，多态性比率为97.56%，平均每条引物的多态信息含量为0.438[17]；SSR 还可用于黄芪与红芪鉴定的核心引物筛选和验证[25]。刘亚令等[16]利用10 对SSR 引物对来自17 个产地共380个样本分析，发现蒙古黄芪遗传多样性水平要高于膜荚黄芪，其遗传变异主要发生在居群内。贺润丽等[18]利用MISA 对蒙古黄芪转录组序列长度在1 kb以上的18 040条unigene进行SSR 位点信息搜索，在其转录组共搜索到5640 个SSR，分布于4462 条unigene，SSR 位点出现频率为31.26%，平均每6514 bp 含1 个SSR 位点，说明黄芪群体间及群体内存在大量的SSR位点，可用于黄芪种质资源的鉴定。本研究基于文献挖掘，选用15 对引物扩增，其中有8 对引物有效，产物分布在100～1000 bp，33 d、22 h 和CK 群体均扩增出21 个较为清晰的条带，平均每对引物可扩增出2.63 个条带，平均每对引物的PIC 分别为0.320、0.427 和0.333，具有中度多态性。由于多态性含量越高的引物品种识别率越高[26]，22 h 群体平均每对引物的PIC 高于33 d 和CK 群体，同时，在GS为0.68处，UPGMA法聚类结果把33 d、22 h 和CK 群体材料分成4 个、5 个和4 个类群，说明22 h 群体遗传多样性高于33 d 和CK 群体，这也进一步印证了形态变异的结果。但本研究所用引物扩增出的条带数少，一是可能采用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离PCR 扩增产物，虽然可以有效分离微卫星DNA 差异条带[27]，但由于SSR 主要表现为2～5 个核苷酸重复次数的变化，多态性片段长度的差异可以小到2～4 bp[28-29]，故需要进一步提高其浓度范围使分离范围变小，分辨率提高；二是前人研究的样本存在地域复杂性和种质来源的差异，而本研究仅采用同一来源的膜荚黄芪种子通过对航天搭载建立的SP2代分析，更能揭示航天搭载方式对2 年生群体的诱变作用，“长征七号”搭载诱变22 h创造变异的效率更大。选择更高浓度的琼脂糖凝胶电泳对药材根及其品质和产量性能的SSR 分析将是下一步研究的重点，以提高膜荚黄芪优良新品种选育的效率。

4.3 表型性状和分子标记聚类结果不一致的可能原因

本研究中2 种聚类方法结果不一致，这与郑道君等[30]通过表型性状结合区间SSR 标记和相关序列扩增多态性标记技术对中国南瓜海南农家品种进行分析得到的聚类结果相一致，也与Ferriol 等[31]对南瓜的分析结果一致。此外，石胜友等[32]对56 份杧果种质资源进行遗传多样性分析发现，基于表型性状和扩增片段长度多态性聚类结果并不完全一致。推测其原因一方面是植物表型性状由多个不同基因型决定；另一方面受引物数量限制，SSR 标记得到的基因位点数较少。由多个基因决定的表型性状，SSR 标记检测到的基因位点可能只是多个基因中的一部分，并不能全面反映植物DNA 信息，且某些检测到的多态位点不一定在表型性状中表现出来。此外，本研究用于分析的表型性状也仅是膜荚黄芪表型的一部分。以上原因可能导致表型聚类和分子标记聚类结果不一致。

5 结论

优异种质资源是育种的物质基础，创造遗传丰富多样的优异种质是新品种选育的保障。基于表型性状和SSR 分子标记分析，揭示航天搭载的膜荚黄芪SP2代2 年生群体存在丰富的遗传多样性，33 d 和22 h群体的平均CV分别为29.37%和26.17%，平均H′分别为1.27 和1.22，平均每对引物的PIC 分别为0.320 和0.427，聚类结果能明显区分出不同类别的植株，且22 h 群体遗传多样性高于33 d 群体，表观性状间的差异性较大，说明航天搭载创造了较丰富的遗传多样性选择群体，下一步研究将对地上矮秆植株进行根部性状筛选，以期选育符合育种目标的优良膜荚黄芪新品种。