葡萄叶面肥富硒特性及可溶态硒分布研究

阙小峰，余 雁，方志成，司文会，胡雪平

（1.苏州农业职业技术学院食品科技学院，江苏 苏州 215008；2.苏州事达泰信标准技术有限公司，江苏 吴中 215100；3.苏州昆山巴城葡萄种植园，江苏 昆山 215311）

硒是人体必需的微量元素，具有清除体内自由基、解毒和排毒、抗氧化、清除胆固醇、增强人体免疫力、抗癌和防癌的作用，被誉为“抗癌之王”［1］。调查显示，中国约有72%的国土面积不同程度缺硒，成人日平均硒摄入量为26～32 μg，低于中国营养协会推荐的摄入量 50～250 μg［2］。研究证明，植物性产品中有机硒的生物利用率大于无机硒盐［3］，利用植物对硒的生物转化及富集作用，提高植物可食部分硒的含量，是补充人体硒含量最经济有效和安全的方法。

本研究结合苏南地区优质绿色葡萄产业发展趋势，选用夏黑葡萄作为研究对象，通过施叶面硒肥的方式进行富硒葡萄栽培，采用HG-AFS 法测定葡萄中硒含量，研究不同浓度的硒肥对葡萄果实中硒含量的影响和施硒肥时期对夏黑葡萄果实硒含量的影响，找到最佳的施硒梯度和时间，探讨以叶面喷施氨基酸硒肥生产富硒葡萄的应用效果，为推广应用葡萄富硒生产技术及产品综合开发利用提供理论依据；再采用HPLC-ESI-MS 法对富硒葡萄的有机硒含量进行分析测定，比较不同形态硒的相对含量，了解其不同可溶态硒的分布规律，为富硒栽培技术提供理论基础，以实现缺硒区域人群安全有效补硒。

1 材料与方法

1.1 试验材料

5 年生夏黑葡萄植株，每公顷产量在2.7 万kg 以上。试验材料由苏州昆山巴城万亩葡萄生产基地提供。

1.2 富硒试剂

富硒试剂由江苏省食品安全快速检测工程技术研究开发中心、苏州农业职业技术学院食品科技学院葡萄富硒项目课题组联合研制，浓度为20 g/kg（以Se（Ⅳ）计），富硒剂中含有高浓度硒元素（亚硒酸钠、氨基酸螯合硒等含硒化合物，以硒元素0.1%～30.0%（质量/体积，M/V）计）、氨基酸营养素（谷氨酸等，0.1%～5.0%（M/V）计）、促吸收剂（环糊精、碳酰二胺等，0.001%～1.000%（M/V））和辅助营养物质（磷酸盐、硫酸盐、葡萄糖等物质，0.01%～20.00%（M/V）），试验时稀释使用。以上试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 硒肥不同浓度试验 试验葡萄每333.5 m2分为一区，将浓缩氨基酸硒液对去离子水稀释，根据植物的硒安全限值，以0、50、100、150、200、250、300、400、500 mg/kg 的硒肥，从夏黑葡萄第一次果实膨大期（幼果发育期）开始，每隔15 d 喷施1 次，直至果实采收前15 d 停止，共喷施6 次。第二年不施肥，依靠土壤中残余硒吸收积累。

1.3.2 葡萄不同时期叶面喷施硒肥试验 试验葡萄每333.5 m2分为一区，将浓缩氨基酸硒液按“1.3.1”试验确定的最佳富硒浓度，经对去离子水稀释后，依次从葡萄植株的绽叶期、初花期、盛花期及幼果发育期开始叶面喷施富硒试剂，每隔15～20 d 喷施1 次，直至果实采收前15 d 停止，共喷施8～10 次，喷施氨基酸硒叶面肥总量不变，随着葡萄生长周期变化，适当缩短喷施时间间隔。试验期间葡萄的施肥、除虫除草、修剪、施肥追肥等管理按正常情况进行。

1.4 样品处理及硒含量和可溶态含量检测

1）样品处理。收获成熟的葡萄去梗去蒂，先用大量自来水洗净表皮，再用去离子水洗涤3～4 次，平铺在实验台上，自然风干果实表面的水分后，放入-85 ℃的冰箱中冻干24 h，然后将葡萄样品置于真空冷冻干燥系统（真空度3.5 Pa，温度-55 ℃）中放置48 h，取出后再放入冷冻干燥器中干燥，获得富硒葡萄样品。第二年收获葡萄处理过程同上。

2）硒含量测定。依据GB 5009.93—2010《食品安全国家标准食品中硒的测定》，采用氢化物-原子荧光光谱法（HG-AFS 法）［4，5］对试验葡萄中的硒含量进行测定。

3）硒可溶态测定。采用分离检测联用技术［7］高效液相色谱-电喷雾串联质谱联用技术（HPLCESI-MS）法来检测各可溶态硒含量［6-8］。检测过程在苏州事达泰信标准技术有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 硒肥不同浓度对夏黑葡萄果实硒含量的影响

硒肥不同浓度对夏黑葡萄果实硒含量的影响见图1。由图1 可知，2019 年叶面喷施氨基酸硒肥的葡萄硒含量要远高于2020 年种植的葡萄；硒肥浓度对葡萄中的硒含量有很大影响。硒肥浓度在0～250 mg/kg 时，夏黑葡萄中的硒含量随施硒浓度递增不断增加；当硒肥浓度为250 mg/kg 时，葡萄中硒含量达 119.7 μg/kg；当硒肥浓度超过 250 mg/kg 时，葡萄中的硒含量则随浓度增加而减少。表明低浓度叶面硒肥利于葡萄果实中硒的富集，浓度过高时则会对葡萄吸收硒的能力产生抑制作用［9］。2020 年种植的夏黑葡萄中硒含量大大减少，富硒含量最高为19.2 μg/kg，明显不符合生产富硒葡萄的要求［10］。这表明土地中的硒一部分向葡萄中转移，另外一部分发生水土流失，土壤作为硒源的能力变差，且根部富硒明显不利于葡萄富硒，需在下一年再重新施加叶面硒肥才能达到生产富硒葡萄的目的。由此可确定叶面氨基酸硒肥浓度250 mg/kg 为最佳硒肥浓度，可以促使葡萄吸收大量的硒，又不影响其生长发育，可为大面积种植富硒葡萄提供参考。

图1 硒肥不同浓度对夏黑葡萄果实硒含量的影响

2.2 喷施硒肥时期对夏黑葡萄果实硒含量的影响

从夏黑葡萄生长发育的绽叶期、初花期、盛花期及初果期等不同时期开始叶面喷施氨基酸硒肥，葡萄成熟前15 d 采集样品，检测夏黑葡萄果实含硒量、土壤样品（含富硒地块土壤、未富硒地块土壤），测定结果见表1。由表1 可以看出，分别从葡萄绽叶期、初花期、盛花期、初果期开始喷施硒肥，葡萄果实内富集的硒含量分别为138、108、46、28 μg/kg，分别是对照组硒含量的 27.6、20.4、8.8 和 6.0 倍。从图 2 可见，葡萄果实中的硒含量随着施硒时期的推迟呈下降趋势，两者显著相关（R2=0.959 4），从绽叶期开始富集硒，最终葡萄果实硒含量是盛花期、初果期的3.0 和 4.9 倍，总硒量最高达 138 μg/kg，夏黑葡萄富硒试验效果明显。

图2 夏黑葡萄不同富硒时期与果实硒含量的相关性

表1 不同生长时期开始喷施硒肥后夏黑葡萄及土壤的硒含量 （单位：μg/kg）

研究表明，添加外源硒肥，葡萄果实能吸收存储更多的硒。叶面喷施氨基酸硒肥显著增宽了葡萄叶片面积，改善了叶片质量；增加了叶片硒素营养，提高了植物体叶片的总糖、还原糖、叶绿素、可溶蛋白质的含量，降低了粗纤维和亚硝酸盐的含量；提高了叶片净光合速率，有助于增强植物叶片的光合作用，促进植物生长，提高产量和增加抗逆性［11，12］。因此，从葡萄生长发育初期开始叶面喷施氨基酸硒肥，有助于硒更早地贮存在植物叶片内，进而通过叶片的生物作用将硒转运至葡萄果实内，是实现生产富硒葡萄的有效途径，相比于根部吸收富硒要更有效。同时，通过对富硒组和对照组土壤中硒含量的检测发现，其硒的含量基本相同，分别为79、78 μg/kg，可见土壤中硒含量虽高，但葡萄生长发育过程中从土壤中吸收转化硒的几率很小，对葡萄果实中的硒含量增加没有明显效果。因而，选择夏黑葡萄生长发育的初期（绽叶期）开始通过叶面喷施硒肥的方法富硒，葡萄成熟时果实内所含硒量较高，能有效增加葡萄硒含量。

2.3 富硒夏黑葡萄果实中可溶态硒的分布

在不同施硒浓度的富硒葡萄中总硒量测定基础上，选择最佳富硒浓度（250 mg/kg）的葡萄样品，采用不同浸提剂（0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl、pH 7.2 Tris-HCl、去离子水）提取富硒葡萄中不同可溶态硒［13］（碱溶态、酸溶态、Tris-HCl 态、水溶态），选择不同浸提温度（20～60 ℃）和浸提时间（20～100 min）提取富硒葡萄中的碱溶态硒、水溶态硒、酸溶态硒和Tris-HCl 态硒，分析各浸提液中不同形态硒含量的变化规律，从而在最佳提取条件下对葡萄中的不同可溶态硒进行定量分析。

由图3a 可知，不同浸提温度对富硒葡萄硒可溶态分布影响差异明显。碱溶态硒随温度升高表现出先上升后降低的趋势，在40 ℃时硒提取量最高，而酸溶态硒、Tris-HCl 态硒和水溶态硒含量在不同浸提温度条件下表现平缓，且硒提取量显著低于碱溶态硒。原因可能是，经喷施叶面氨基酸硒肥，葡萄利用叶片生理作用吸收富集，与葡萄中主要营养成分多糖和蛋白转化形成硒蛋白或硒多糖类有机硒，温度在20～40 ℃，随温度升高时，蛋白态硒和多糖态溶解度增大，可溶态硒提取率升高；但温度继续升高时，蛋白、多糖类化合物结构破坏，分子表面亲水基团的数量降低，引起可溶态蛋白质或多糖类大分子化合物聚集沉淀，造成浸提的可溶态硒含量降低［14，15］，当温度升至 40～60 ℃时碱溶态硒的含量逐渐下降。由此可知，碱溶态对有机硒的吸收利用较为明显，最佳浸提温度为40 ℃。人体内血液pH 在7.0～7.2，弱碱性的血液环境有利于碱溶态硒的吸收利用，有助于人体补硒。

由图3b 可知，不同浸提时间对富硒葡萄可溶态硒的变化影响不同，表现为碱溶态硒与酸溶态硒含量都随着浸提时间的延长而增加，且碱溶态硒含量表现更为突出；而水溶态硒与Tris-HCl 态硒含量对浸提时间的变化不明显。说明碱液能够随着时间的增加溶解更多的硒蛋白或硒多糖等有机态硒。酸液浸提时，部分无机态硒也随着浸提时间延长逐渐被浸提，最终趋于稳定。结合测定分析，浸提时间越久，对碱溶态硒提取越有效，考虑到生产实际，水溶态硒与Tris-HCl 态硒的浸提时间为40 min，碱溶态硒与酸溶态硒的浸提时间以80 min 为宜。

图3 不同条件（浸提温度、提取时间）对富硒葡萄果实中可溶态硒的影响

3 小结

在夏黑葡萄植株生长的不同时期，通过叶面喷施氨基酸硒肥栽培富硒葡萄，考察其富硒特性及硒可溶态分布规律。结果表明，最佳富硒硒液浓度为250 mg/kg，葡萄富硒效果显著；通过从夏黑葡萄不同生长时期（绽叶期、初花期、盛花期、初果期）开始喷施叶面硒肥，发现绽叶期就开始定期喷施叶面硒肥可显著改善葡萄叶片质量，提高叶片净光合速率，通过叶片的吸收转化，有助于葡萄果实的有机态硒富集，夏黑葡萄硒含量最高达138 μg/kg。能满足人体每日硒摄入量50～250 μg/kg 的需求［16］，实现富硒葡萄的生产，且富硒效果明显。进一步通过测定不同浸提剂（NaOH、HCl、Tris-HCl、H2O）在浸提温度、时间等因素下提取的各可溶态硒含量，分析总结出硒在葡萄中的变化分布规律，碱态硒在40 ℃、80 min下有最好的提取率，有利于人体补硒，同时也为富硒葡萄栽培、综合开发利用提供了参考。