骨形态发生蛋白-7的过表达载体对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

黄生祥，梅海波，赫荣国，刘 昆，唐 进，伍海燕

儿童慢性骨髓炎是儿童骨科领域的常见病和多发病[1-2]，其导致的骨缺损发生率较高，如未能予以有效治疗将造成骨骼畸形，对患儿的生长和生活将造成不可挽回的损失与伤害[3-4]。目前，对于儿童骨髓炎导致的骨缺损缺少有效的治疗方案，大多依靠患儿自身的愈合能力和药物，但疗效不佳[5-6]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能，可以分化成骨细胞、软骨细胞等人体细胞，而且BMSCs来源于患者自体，移植后可避免机体的排斥反应。但是干细胞具有易老化、分化方向不定和传代少的缺点[7-8]。本研究利用基因编辑技术构建骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的过表达载体，通过慢病毒转染BMSCs，探讨其促成骨分化的作用，旨在为儿童骨髓炎骨缺损的治疗提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料胎牛血清购自BI公司；DMEM培养基购自Invitrogen公司；2.5 g/L胰蛋白酶、茜素红染液、碱性磷酸酶(ALP)染液等均购自北京碧云天生物有限公司。

1.2 BMSCs的获取和培养利用无菌骨穿针从10例健康志愿者的髂骨中取新鲜骨髓组织，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行稀释，然后加入0.01 mol/L的胎牛血清，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，采用差速培养法进行BMSCs的培养。本研究已获得我院伦理委员会批准。

1.3 BMSCs的鉴定采用流式细胞仪检测BMSCs中CD33、CD45、CD90、CD106等表面蛋白的表达，并检测其表达含量。

1.4 BMP-7过表达载体的构建利用PubMed数据库中GENE Bank查询BMP-7的编码基因内含子序列，以XhoI/BamHI为切入点设计单链mRNA序列，构建BMP-7的过表达载体。慢病毒的包被需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，获得高滴度慢病毒。将P2代BMSCs同质化处理后，根据感染复数(MOI)值转染慢病毒，然后利用倒置荧光显微镜观察转染结果。

1.5 BMSCs的分组根据BMSCs是否转染BMP-7过表达载体分为转染组和未转染组(作为对照)。

1.6 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测慢病毒转染14 d后收集细胞，加入1 ml的Trizol试剂，提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书将单链RNA反转录为cDNA，4 ℃保存，RT-PCR检测试剂盒检测RNA水平。引物序列如下：BMP-7：正义链5′-AGATTCTAAAGGTGCGTTGCTGCC-3′,反义链5′-TCTATTAACTGTAATCCTCCTCTGG-3′；ALP：正义链5′-TTATGCGTAAGTT CCGGTAATGCCC-3′，反义链 5′-AATTCCGTGTGTACGTGCTGCTGAC-3′；Runt相关转录因子2(Runx2)：正义链5′-TTAAGTGCTCTCG-ACGTCGCACTGCT-3′，反义链5′-AATTGCTGCTAG-CTGACGTACGTACG-3′；骨钙素(OCN)：正义链5′-TTCGTGTGTGTGCACACATGACACAA-3′，反义链5′-TTGTGTGTGCACACAGTGTAAATGTCA-3′；3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)：正义链5′-GCGTGTACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反义链5′-TGGTTTGCCTAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.7 茜素红染色慢病毒转染14 d后收集细胞，接种于6孔板中进行培养，4%多聚甲醛固定后按照茜素红染色试剂盒说明书要求，将茜素红染液加入6孔板中进行孵育，倒置光学显微镜下观察。

1.8 ALP染色慢病毒转染14 d后收集细胞，接种于6孔板中进行培养，4%多聚甲醛固定后按照ALP染色试剂盒说明书要求，将ALP染液加入6孔板中进行孵育，倒置光学显微镜下观察。

2 结果

2.1 BMSCs的培养结果和表达含量见图1。CD90和CD106的表达为60.2%和58.3%；CD33和CD45的表达为3.4%和2.6%。

图1 BMSCs的培养和表达(×200) A.原代BMSCs；B.第2代BMSCs；C.第2代BMSCs表面蛋白CD90的表达为60.2%；D.第2代BMSCs表面蛋白CD106的表达为58.3%；E.第2代BMSCs表面蛋白CD33的表达为3.4%；F.第2代BMSCs表面蛋白CD45的表达为2.6%

2.2 慢病毒转染BMSCs的转染结果见图2。慢病毒转染BMSCs的转染滴度为3×108TU/ml。

图2 慢病毒转染BMSCs的转染结果(×200) A.荧光下视野；B.白光下视野

2.3 BMP-7以及成骨分化标志物ALP、Runx2和OCN的mRNA的相对表达量见图3。BMP-7以及成骨分化标志物ALP、Runx2和OCN的mRNA的相对表达量转染组均明显高于未转染组(P<0.05)。

图3 BMP-7以及成骨分化标志物ALP、Runx2和OCN的mRNA的相对表达量 与未转染组比较：*P<0.05

2.4 茜素红染色结果见图4。转染组肉眼可见明显的红色染色区域，镜下可见大量钙结节点。

图4 茜素红染色 A.未转染组肉眼视野；B.未转染组镜下视野(×200)；C.转染组肉眼视野；D.转染组镜下视野(×200) 图5 ALP染色 A.未转染组肉眼视野；B.未转染组镜下视野(×200)；C.转染组肉眼视野；D.转染组镜下视野(×200)

2.5 ALP染色结果见图5。转染组肉眼可见紫色染色区域，镜下可见ALP染色呈强阳性。

3 讨论

儿童骨髓炎导致的骨缺损在临床上较常见，骨髓炎所致骨坏死、骨溶解、骨吸收以及局部的清创手术均可造成胫骨不连接，合并大段骨缺损和肢体短缩畸形，其临床治疗具有难度大。既往研究[9]表明，BMSCs复合异种骨基质明胶可以有效修复大鼠桡骨缺损，在组织支架的诱导作用下可以促进BMSCs向骨细胞转化，进而修复骨缺损。但是，这种方法需要符合特定条件的组织工程支架，也就是需要特殊的“土壤”，BMSCs这个“种子”才能更好的在其内生长并且分化。另外，临床应用的安全性有待调查[10]。研究[11]发现，利用慢病毒构建基因载体转染BMSCs后，不影响BMSCs表型，说明利用基因工程原理构建基因过表达的BMSCs也是提高“种子”有效分化的一种手段。本研究基于此理论构建BMP-7过表达质粒慢病毒载体的BMSCs，制作新型“基因种子”，为骨缺损的研究做准备。

近年来，干细胞的应用受到明显限制，主要存在以下几个问题[12]：① 干细胞易老化，存活代数较少；② 分化程度低，且分化方向不定，无法达到预想结果。后基因组时代的标志是利用siRNA或者snRNA基因沉默或者过表达，从而增强或者沉默目的基因的功能。本研究的特色就是应用基因修饰的分子原理构建BMP-7的过表达载体，体外培养BMSCs，慢病毒转染BMSCs，探究BMP-7的过表达载体对干细胞的促成骨分化作用，以期为临床上儿童骨髓炎导致的骨缺损的治疗提供思路与方法。

BMP-7是骨形态发生蛋白家族中的一员[13-14]。有研究[15]利用重组骨形态发生BMP-7用于脊柱融合，可见BMP-7具有一定的安全性。既往研究[16]显示，采用ALP作为前骨细胞的分子标志物在前骨细胞向成熟骨细胞的分化中起到重要作用。另外，Runx2也是一种成骨分化的分子标志物[17]，可以与顺式转录作用原件结合，从而促进骨桥蛋白、骨涎蛋白的合成，进而促进骨细胞分化。本研究以ALP、Runx2、OCN作为成骨分化的标志物，利用RT-PCR进行定量检测，结果表明慢病毒转染BMP-7过表达载体后，ALP、Runx2、OCN的表达量明显升高。ALP染色结果：转染组肉眼可见紫色染色区域，镜下可见ALP染色呈强阳性；茜素红染色结果：转染组肉眼可见明显红色区域染色，镜下可见大量钙结节点。

综上所述，慢病毒转染BMP-7可以促进BMSCs成骨分化。本研究的不足：① 转染方法的选择问题。因为慢病毒载体是一种灭活的人类免疫缺陷病毒，虽然转染率较高，但安全性仍有待进一步改进。② 仅证明了BMP-7转染后可以促进BMSCs成骨分化，但具体机制需要进一步研究。