PRSS1和SPINK1基因热点突变检测对遗传性胰腺炎高危人群的诊断价值

张文清,2 雷珂2 魏宏云 王彩霞3 王玲珍3 陈志红3 李晓宇

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266003 1 消化内科； 2 医学研究中心，肿瘤免疫及细胞治疗中心； 3 儿童医学中心)

遗传性胰腺炎(hereditary pancreatitis，HP)是一种少见的常染色体显性遗传性疾病，其临床表现与复发性急性胰腺炎(recurrent acute pancreatitis，RAP)和慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)相似，占胰腺炎总数的1%[1]。HP与其他原因导致的胰腺炎相比，具有发病年龄早、家族聚集和胰腺癌发病率高等特点[2]。目前HP的发病机制仍不明确，既往遗传学研究的结果表明，人阳离子胰蛋白酶原(PRSS1)基因突变可引起常染色体显性HP。除此之外，HP常见突变基因还有丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型(SPINK1)基因和糜蛋白酶C(CTRC)基因等[3]。由于HP与RAP、CP临床表现类似，基因热点突变的检测对明确诊断意义重大。有遗传变异的HP患者建议40～75岁每年行MRI或CT检查以确定是否有胰腺肿瘤发生[4]。对于携带囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)基因突变CP患者可考虑进行基因治疗[5]。遗传咨询和基因测序可帮助HP患者明确诊断，并及早干预，以预防癌症的发生。PRSS1和SPINK1基因突变或多态性是HP最常见的突变，据报道中国人群PRSS1基因的常见突变位点为c.86 A>T、c.346 C>T、c.364 C>T、c.365 G>A、c.623 G>C，SPINK1基因常见突变位点为c.101 A>G、c.194+2 T>C[6]。本研究通过检测PRSS1和SPINK1基因的这7个最常见的热点突变，对HP高危人群进行筛选并明确病因，以探讨PRSS1和SPINK1基因热点突变检测对HP高危人群的诊断价值。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选择2020年8月—2021年9月于青岛大学附属医院消化内科就诊的HP高危患者，参考HP患者基因检测适用人群的标准[7-8]，本研究的HP高危患者纳入标准为：有CP、RAP和儿童胰腺炎家族史者；原因不明的RAP或CP患者；亲属有HP确定致病基因突变者；25岁以下发病的特发性CP患者。最后符合条件的患者共6例，男2例，女4例；成人3例，儿童3例；临床表现为急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)1例，RAP 4例，CP 1例；血清淀粉酶升高者3例，空腹血糖偏高者3例，有腹痛表现者5例，有脂肪泻者2例，超重者1例，体重下降者1例，有家族史者1例；6例患者均无并发症发生；腹部CT检查胰腺有不同程度的低密度影、轮廓饱满、周围脂肪间隙密度增高、多发斑点状钙质影等异常影像学表现者4例。

1.2 方法

采集6例患者的外周静脉血各3 mL，然后使用上海生工柱式血液基因组DNA抽提试剂盒提取DNA(B518253-0100)，使用超微量分光光度计检测并计算提取的DNA的浓度，将DNA稀释至终浓度0.05 g/L以用于PCR检测。使用primer blast软件来设计覆盖PRSS1和SPINK1基因7个突变位点的PCR引物，见表1。委托华大基因科技有限公司完成引物合成。

PCR扩增体系：总反应体系10 μL，其中DNA聚合酶(5×106U/L)0.2 μL，10-5mol/L各对引物混合物1 μL，0.05 g/L DNA模板2 μL，2×buffer 5 μL，超纯水1.8 μL。置于PE 9700热循环仪上：94 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s -0.5 ℃/Cycle，72 ℃ 1 min，循环20次；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环15次；72 ℃延长5 min。最后4 ℃保存。PCR产物由华大基因科技有限公司测序平台进行Sanger测序。对于测序中发现的非热点突变，以CP遗传风险因素数据库(http://www.pancreasgenetics.org/index.php)中已知致病突变和可能致病突变认定为HP相关突变，数据库中未有的突变，在PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库和ClinVar数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)中查找是否有突变相关报道和致病性分析结果。

表1 PRSS1和SPINK1基因7个突变位点的PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for detection of seven mutation sites in PRSS1 and SPINK1

2 结 果

基因检测结果显示，6例患者中有5例检测出基因突变，其中3例为PRSS1基因杂合性突变，2例患者为SPINK1基因杂合性突变。5例患者的具体情况如下：患者1基因检测发现有非热点突变PRSS1 c.455-33 C>T突变，目前未见文献报道，为内含子突变，来源未知，患有2型糖尿病(图1A)。患者2基因检测结果发现有PRSS1 c.235G>A突变，来源于母亲，其母有相同PRSS1 c.235 G>A阳性突变，但没有临床表现(图1B)。患者3基因检测结果发现有SPINK1 c.194+2 T>C突变，来源于父亲，其父具有相同SPINK1 c.194+2 T>C阳性突变，但没有临床表现(图1C)。患者4基因检测结果发现有SPINK1 c.194+2 T>C突变，来源未知，有胰腺炎家族史，其儿子、妹妹以及妹妹的子女均有胰腺炎发作病史，其妹妹检测到同样的基因突变(图1D)。患者5基因检测结果发现具有PRSS1 c.364C>T突变，来源于其父亲，其父亦具有相同的PRSS1 c.364 C>T(p.R122H)阳性基因突变，但没有临床表现(图1E)。患者3和患者5在诊断时无胰腺炎家族史，但是其直系亲属筛查时发现有基因突变携带者。

A～E分别为患者1～5图1 发生PRSS1、SPINK1基因突变5例患者的正向测序图Fig.1 Forward sequencing results of 5 patients with PRSS1 and SPINK1 mutations

3 讨 论

HP临床表现缺乏特异性，与其他原因导致的AP、CP较难区分。本研究6例患者中5例有腹痛表现，2例有脂肪泻症状，除此之外，HP还有如家族聚集性、发病年龄早(儿童及少年就开始发病)及胰腺癌发病率高等特点，这为凭借临床表现诊断HP增加了难度。胰腺组织反复炎症易导致胰腺部分或广泛纤维化、腺泡萎缩、胰管内结石形成、假囊肿形成，最后进展为CP，并可能伴有不同程度的胰腺内、外分泌功能受损。

PRSS1和SPINK1基因突变或多态性是HP最常见的致病原因。通过对这两个基因的热点突变进行检测，可以快速筛查出HP患者，从而进行早期干预治疗[9]。PRSS1基因突变通过改变CTRC依赖性胰蛋白酶激活和降解进一步导致自身活化增强[10]。PRSS1基因突变的患者较早出现胰腺外分泌功能不全和糖尿病[11]。一项针对HP患者及其家族成员以问卷调查形式进行的队列研究结果显示，217例携带PRSS1基因突变的患者中最常检测到的突变是p.R122H(83.9%)，其中有37例携带PRSS1基因突变患者在研究期间死亡，有5例死于胰腺癌[12]。由于具有胰腺癌变的高风险，因此建议对HP患者进行胰腺恶性肿瘤的主动监测[13]。在日本所进行的一项全国性调查结果显示，对HP患者及其家庭的基因检测中41%发现有PRSS1基因突变，36%发现有SPINK1基因突变[9]。我国针对3个HP家系中10例患者和3例散发病例的回顾性分析显示，3个家系中的HP患者起病年龄为8～46岁，其中<20岁起病7例，>20岁起病3例，以PRSS1基因突变多见，其中1个两代成员均发病的家系中,存在随代数延续、发病年龄提前的现象[14]。刘奇才等[15]针对1个HP家系的2例胰腺炎患者的PRSS1基因外显子进行测序，显示均为PRSS1基因3号外显子纯合子突变(c.415T>A)。

成人CP的主要病因是过量饮酒，而在儿童中，CP的病因多种多样，包括基因突变、解剖异常和代谢紊乱等。ORACZ等[16]针对265例CP患儿的临床资料进行分析显示，有41例患儿被诊断为HP(15.5%)，诊断为HP患儿中88%家族史呈阳性，并伴随PRSS1基因突变。相比非HP患儿，患有HP的儿童临床表现更为严重。特发性CP患儿应考虑到遗传原因，即使患儿没有阳性家族史。一项研究报告了1例13岁的特发性CP男孩，在幼儿期就存在不明原因的胰腺炎发作史，基因检测发现其携带了PRSS1基因的c.623G>C(p.G208A)突变和CTRC基因的c.180C>T(p.G60G)突变，为杂合状态；对其家庭成员进行基因检测显示，其母亲为这两种基因突变的携带者，但无临床症状，其外祖母也发现有PRSS1的p.G208A突变[17]。本研究的3例儿童患者中，其父亲或母亲也均检测出相同的基因突变，为突变携带者，但无相关临床表现。由于HP是一种复杂的遗传性疾病，受到环境和遗传因素相互作用的影响，本研究中的3例患儿可能受其他未知风险因素的影响，而这些因素可能在其父母身上发挥的影响不大。推测基因突变的携带者或许可通过改变生活方式、合理饮食等措施，积极预防胰腺炎的发生。

由于PRSS1和SPINK1基因突变的比例很高，为了正确评估CP、RAP和HP患者，即使那些没有明显的胰腺炎易感因素或家族史的患者，也应该考虑进行基因检测[18]。目前对HP的研究一般都是全基因组外显子测序，费用大、耗时长。本研究通过Sanger测序分析对符合HP筛查条件的6例胰腺炎患者的SPINK1、PRSS1基因外显子进行测序，结果发现2例为SPINK1 c.194+2 T>C突变，1例为PRSS1 c.235 G>A突变，1例为PRSS1 c.364 C>T突变以及1例为PRSS1 c.455-33 C>T突变。本研究仅仅针对了6例HP高危患者进行了Sanger测序，即有5例检查出基因突变，提示该检测方法的阳性率还是比较高的。另外本研究检测到的PRSS1 c.455-33 C>T突变之前未见相关报道，PRSS1 c.235 G>A突变为首次在中国人群中发现。对于新发现的突变位点可以继续进行迷你基因检测，探索与非编码RNA的相关性以及致病性等。对于未检出常见基因突变的患者，可以考虑进行耗时更长、花费更大的二次基因检测，如对已发现的HP基因外显子靶向测序或全部基因外显子测序。

综上所述，在HP高危人群中利用PCR扩增联合Sanger测序法检测PRSS1和SPINK1基因的7个热点突变，能快速、高效地发现HP相关的遗传基因突变位点，操作简便，有利于大规模人群筛查，收集高危人群流行病学数据，为完善HP诊断流程寻找参考依据。及早发现上述基因突变携带者，进行科学管理，可以有效预防CP发作、胰腺功能损伤，有利于预防癌变，提高患者生活质量。同时，对于那些没有明显的胰腺炎易感因素或家族史的患者，也建议进行基因检测，及早发现病因，并及时干预治疗，改善患者预后。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

伦理批准和知情同意：本研究涉及的所有试验均已通过青岛大学附属医院医学伦理委员会的审核批准(文件号QYFYWZLL26902)。受试对象或其亲属已经签署知情同意书。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experiments involved in this study have been reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No. QYFYWZLL26902). Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者贡献：李晓宇、雷珂、王玲珍参与了研究设计；张文清、魏宏云、王彩霞和陈志红参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions： The study was designed byLIXiaoyu,LEIKe,andWANGLingzhen. The manuscript was drafted and revised byZHANGWenqing,WEIHongyun,WANGCaixia, andCHENZhihong. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.