紫外分光光度法测定亚硝酸盐含量的不确定度评定

李斯斯 李鹏

【摘 要】文章简要综述了国内外亚硝酸盐的检测方法，根据《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）对紫外分光光度法测定乳粉中亚硝酸盐含量进行不确定度评定。通过建立数学模型，分析其测定过程，确定影响结果的不确定度因素，从而计算亚硝酸盐含量的不确定度及扩展不确定度。根据主要不确定度来源，寻找有效降低结果不确定度的途径。

【关键词】分光光度法;乳粉;不确定度;亚硝酸盐;扩展

【中图分类号】O657.32 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2022）02-0046-04

0 引言

随着绿色生态环保理念的普及及消费者消费观念的转变，绿色产品逐渐成为市场主流[1]。然而近年来食品质量安全事件频发，居民乳制品消费信心受到重创[2]，乳制品质量安全受到消费者重点关注，尤其针对亚硝酸盐等指标，使得众多研究者[3-4]对GB 5009.33—2016检测方法进行了改进及探讨。

亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，其性状为白色至淡黄色粉末或颗粒状。因其具有较强氧化性，导致人体血液中低铁血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白，失去携氧功能，使人缺氧而发生中毒。亚硝酸盐致癌机理可大致概括为胃酸条件下，亚硝酸盐与某些物质反应生成强致癌物N-亚硝胺，甚至通过胎盘进入胎儿体内，造成幼儿畸形。通常情况下，人体一次性摄入0.3 g以上的亚硝酸盐会导致急性中毒甚至死亡。因而，保障乳制品安全、降低风险是乳企义不容辞的责任。

本研究通过对亚硝酸盐测定过程进行分析，确定不确定度的主要来源，确保亚硝酸盐结果的准确性，以期为评定测量结果质量提供有力的理论依据及指导。

1 食品中亚硝酸盐的检测方法

亚硝酸盐指标作为典型的污染物质，国家监督执法部门加强对食品安全的抽查及监管，其检测方法成为国内外研究学者的课题热点，大致分为以下几类。

1.1 光度法

光度法基本原理为利用溶液中亚硝酸盐在一定波长下具有选择性吸收，其规律符合朗伯-比尔定律。其中，重氮偶合比色法（Griess法）最为典型，在弱酸条件下，亚硝酸盐与芳香族胺重氮化，重氮盐与电位偶联剂生成有色的偶氮化合物。常用芳香族胺有硝基苯胺、磺胺酸、对氨基苯乙酮等，电位偶联剂有苯酚、1—苯酚、1—氨基萘、1，3—二氨基苯等。

1.2 荧光法

荧光法是近几年较新的检测方法，其原理主要为亚硝酸盐与非荧光类物质发生重氮化或亚硝化后产生荧光化合物[5]。杜晓阳[6]采用两种方法制备了新型荧光探针NR-β-CD@AuNPs，研究发现该探针灵敏度高，在检测水样中的抗干扰性较强，加标回收率为99.0%～102.0%。

1.3 色谱法

色谱法主要包括液相色谱法（紫外检测器-液相色谱法）、离子色谱法（电导检测器-离子色谱法、抑制电导检测器-离子色谱法、紫外检测器-离子色谱法）、气相色谱法。李华丽[7]采用离子色谱法，对比电导检测器和紫外检测器发现，采用紫外检测器加标回收率为91.7%～97.5%，准确性更高。

1.4 电化学法[8]

亚硝酸盐电化学传感器的检测原理为亚硝酸盐被感应元件中固定于电极表面的具有电活性和催化功能的修饰层催化，发生氧化反应生成硝酸盐，并将电极表面发生的反应参数转化成感应信号，进而测得电化学信号，经电子系统处理后输出并记录。

1.5 快速检测法

快速检测法主要包括亚硝酸盐检测仪、亚硝酸盐检测管、亚硝酸盐检测试纸、亚硝酸盐检测试剂盒。陈敏[9]研制出一种以Whaterman的3 mm滤纸为材料的制作过程简单、保存时间久、检测限低的亚硝酸盐检测试纸，选用对氨基苯磺酸溶液与盐酸萘乙二胺溶液按质量比2∶1作为显色剂，加入20%酒石酸超声溶解后浸泡3 min，40 ℃真空干燥1.5 h。

2 材料与方法[10]

2.1 试剂与设备

2.1.1 基本试剂

试样为随机购买的乳粉。所用其他试剂（包括亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硼酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺等）均为分析纯;水为《分析实验室用水规格和实验方法》（GB/T 6682—2008）规定的一级水。

2.1.2 标准品及标准溶液

亚硝酸钠（NaNO2）：纯度99.90%，基准试剂，天津市光复化学试剂有限公司生产。亚硝酸钠标准溶液（200 μg/mL，以亚硝酸钠计）：称取于110～120 ℃干燥至恒重的亚硝酸钠基准试剂0.100 0 g，加水溶解并移入500mL容量瓶中，定容摇匀，备用。亚硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL）：临用前，于100 mL容量瓶中吸入2.50 mL亚硝酸钠标准溶液，用水定容至刻度，摇匀备用。

2.1.3 设备

紫外可见分光光度计（型号：TU-1901）：北京普析通用仪器有限责任公司生产;电子分析天平（型号：AL207-IC）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产。

2.2 试验方法

2.2.1 原理

试样经提取沉淀后，在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，后与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，通过外标法测出亚硝酸盐的含量。

2.2.2 试样预处理

将乳粉装入足够大的带盖容器中，反复摇晃和颠倒容器使试样混匀。

2.2.3 试样前处理

称取试样10 g置于150 mL具塞锥形瓶中，加入12.5 mL、50 g/L饱和硼砂溶液，加入约150 mL、70 ℃左右的水，混匀，于沸水浴中加热15 min，冷却并放至室温。转移上述试样溶液于200 mL容量瓶中，依次加入106 g/L亚铁氰化钾溶液220 g/L乙酸锌溶液各5 mL，摇匀。加水定容摇匀，放置30 min，过滤，弃初滤液30 mL，剩余濾液备用。

2.2.4 测定过程

于50 mL具塞比色管吸入40.0 mL滤液，另取9个50 mL具塞比色管，依次吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL亚硝酸钠标准使用液。向以上比色管中各加4g/L对氨基苯磺酸溶液2 mL，混匀，静置3～5 min后，各加入2 g/L盐酸萘乙二胺溶液1 mL，用水定容混匀，静待15 min，在波长538 nm处用1 cm石英比色皿，以零管调节零点，测量试样吸光度，以亚硝酸盐含量为横坐标，其吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。同时做试剂空白试验。

2.3 亚硝酸盐含量的测量模型

公式（1）中，X为样式中亚硝酸盐的含量，mg/kg;V1为样式处理液总体积，mL;V0为样液总体积，mL;M为样式的质量，g;c为从标准曲线上查得测定用样液中亚硝酸钠的质量，μg。

3 测量模型的构建

3.1 亚硝酸盐标准工作曲线

Y=K1×c-K0（2）

公式（2）中，Y为亚硝酸钠标准使用液吸光值;c为亚硝酸钠标准使用液的质量，μg;K1为斜率;K0为截距。

3.2 不确定来源简析[11]

根据检测流程分析，本试验方法不确定来源主要由5个部分组成：①制作标准曲线时的不确定度;②试样测定时的不确定度;③试样前处理过程引入的不确定度;④测定试样重复性试验的不确定度;⑤紫外可见分光光度计读取吸光值引入的不确定度。

4 不确定度分量的确定与合成

4.1 制作标准曲线时的不确定度

4.1.1 标准曲线拟合引入的不确定度

将不同质量标准溶液的吸光度各测定3次，得到平均吸光度值分别为0.000，0.014 3，0.029 7，0.044 7， 0.061 3，0.077 7，0.113 0，0.148 3，0.190 0。对数据进行线性最小二乘拟合，得线性方程Y=0.015 09c-0.000 06;相关系数R=0.999 1，斜率K1=0.015 09，截距K0=-0.000 06，属B类不确定度。

对样液进行测定3次，样液中亚硝酸钠的平均质量c0=2.676 7μg。

则拟合直线求样液亚硝酸钠质量时的相对标准不确定度公式如下：

公式（4）中，U1（c）为拟合曲线求样液中亚硝酸钠含量所产生的不确定度;s为通过贝塞尔公式求吸光度时的标准偏差;P为试样溶液测定次数，取值3;m为标准溶液测定次数，取值3;n为标准溶液系列个数，取值9;Yi'为标准溶液吸光度值;K1为标准曲线的斜率，取值0.015 09;K0为标准曲线的截距，取值-0.000 06;ci为各标液中亚硝酸钠的质量，单位为μg;c0试样溶液中亚硝酸钠的平均质量，取值2.676 7μg;ci为各标准溶液中亚硝酸盐的含量，取值5.003 0μg。

4.1.2 亚硝酸钠标准溶液配制的不确定度

配制亚硝酸钠标准溶液的不确定度主要来自基准试剂的纯度、称量过程、定容体积和温度，均属于B类不确定度。

将以上分量合成，则计算亚硝酸钠标准溶液的相对标准不确定度为U2=1.444 1×10-2，将标准曲线引入的不确定度和标准溶液引入的不确定度合成，即Urel（c）=4.772 0×10-2。

4.2 试样测定时的不确定度

4.3 试样前处理过程引入的不确定度

4.3.1 试样称量时的不确定度

试样称量为10 g，其相对标准不确定度为U1rel（m）=4.082 6×10-5。

4.3.2 试样定容体积引入的不确定度（见表3）

试样定容引起的相对标准不确定度U2rel（m）=6.791 6×10-4。

试样称量与试样定容引入的相对不确定度Urel（m）=6.803 9×10-4。

4.4 测定试样重复性试验的不确定度

4.5 紫外可见分光光度计读取吸光值引入的不确定度

5 合成不确定度和扩展不确定度

综上所述，合成相对标准不确定度：

则合成标准不确定度：Uc（X）=4.889 9×10-2×1.34=0.065 mg/kg。

取置信水平区间95%，包含因子k=2，所以扩展不确定度为U=Uc（X）×2=0.13 mg/kg。

6 测量不确定度的报告与表示[14]

乳粉中亚硝酸盐含量为1.3 mg/kg，故其不确定度报告可表示为X=（1.3±0.1）mg/kg（k=2，置信区间95%）。

7 讨论

通过不确定度来源及相对不确定度计算可知，亚硝酸盐测定过程中，标准曲线对结果产生较大影响。在平时检测过程中，应尽可能采用较高精度的玻璃仪器、纯度高的试剂，增加标准工作液的测定次数和试样的测定次数，并掌握检测的关键点，规范操作，以降低结果的不确定度，保证数据准确可靠。

参 考 文 献

[1]王福财.基于消费者绿色偏好视角下乳制品定价模型研究[D].西安：陕西科技大学，2020.

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[4]同瑞婷，宋悦，兰萌.婴幼儿米粉类辅食中亚硝酸盐测定方法的优化[J].农产品加工，2021（13）：70-71.

[5]陈林林，韩可，李伟，等.亚硝酸盐检测方法的研究進展[J].食品安全质量检测学报，2019（11）：3430-3435.

[6]杜晓阳.环糊精功能化金纳米粒子的制备及亚硝酸根离子的检测[D].温州：温州大学，2018.

[7]李华丽，蔡楚勇.离子色谱法测定奶粉中亚硝酸盐含量的优化[J].广东化工，2021（13）：195-196.

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[13]JJG 10—2005，专用玻璃器具检定规程[S].

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