大蒜白腐菌粗毒素活性分析与组分鉴定

朱言杰 马金骏 周冬梅 邓晟 冯辉 魏利辉 陈夕军 王晓宇

摘要：以大蒜白腐菌为材料，分别用正丁醇和乙酸乙酯萃取得到了大蒜白腐病菌粗毒素，采用气相色谱对粗毒素进行了物质组分分析。结果表明，用正丁醇提取的大蒜白腐病菌粗毒素活性高于乙酸乙酯提取的大蒜白腐病菌粗毒素，但二者均可引起大蒜叶片病斑产生，表明其具有生物活性;其中有4种物质被鉴定，分别为2，4-二甲基庚烷、十一烷、3，5，5-三甲基-2-環己烯-1-酮、邻苯二甲酸丁基酯2-乙基己基酯。

关键词：大蒜;白腐病;毒素;正丁醇;组分

中图分类号：S436.33   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）08-0125-03

我国是大蒜生产和消费大国，栽培面积位列世界首位。大蒜属于百合科葱属，作为特色种植作物，其出口创汇地位不断提升。随着大蒜种植面积逐步扩大，其栽培管理模式也随之变化，导致病虫害常发重发，严重制约大蒜产业的进一步发展。大蒜白腐病是危害大蒜的主要要病害之一，在一些地区甚至被称为大蒜的“癌症”。该病在我国大蒜主产区均有发生，严重时病株率可以达到80%以上，导致产量严重损失直至绝收[1-4]。

大蒜白腐病病原菌属于半知菌亚门真菌，其分类鉴定为白腐小核菌，该菌可侵染多种百合科作物，如百合、韭菜、洋葱等[5-9]。病原菌在侵染作物的过程中，会产生几类代谢产物，如酶、毒素、激素等。其中毒素作为一类真菌代谢产物，在寄主与真菌的互作中发挥重要作用。张林青等对大蒜白腐病菌毒素进行了提取，用大蒜幼苗检测根系抑制率方法，对大蒜白腐病菌在不同培养条件下产生粗毒素的能力及粗毒素活性进行了研究，并用GC-MS分析了大蒜白腐病菌毒素的化学组分;组分分析表明其粗毒素含有酯类、酸类、甾体类等化合物，其中月桂酸和邻苯二甲酸可对大蒜根系产生抑制，且邻苯二甲酸对大蒜的致病毒性不如月桂酸[10]。

为进一步探索大蒜白腐病病原菌粗毒素的致病机理，为大蒜遗传育种方面的抗病性鉴定提供理论指导，本研究采用不同的粗毒素分离及鉴定方法，得到了与其他研究有差异的结果。

1 材料与方法

1.1 菌株的转接及培养

大蒜白腐病菌菌株BF3分离自云南省大理市，由笔者所在实验室保存。把保存于PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）固体斜面培养基上的大蒜白腐病菌转接到PDA固体培养基上，在 18 ℃ 恒温培养箱中培养72 h。从转接好的大蒜白腐病菌中挑2块菌丝，接种到20 mL液体查彼克培养基中，置于摇床上振荡培养4～7 d，温度为 18 ℃，直至长出大量菌丝又不产生黑色菌核。

1.2 粗毒素的提取

将获得的大蒜白腐病菌培养液进行过滤，得到的滤液在60 ℃条件下进行旋转蒸发，直至滤液体积到达原体积的1/10，加入等体积的正丁醇。充分振荡摇匀后静置2 h，收集有机相，再次加入正丁醇萃取，萃取3次后，将有机相合并，用旋转蒸发仪进行旋转蒸发去除正丁醇，温度45 ℃，获得的浆状物加水定容至1 mL，即为粗毒素。乙酸乙酯萃取步骤同上。

1.3 粗毒素的致病性鉴定

大蒜品种为G18，取大小一致的30个蒜瓣，放到光照培养箱中，参数设置为光—黑周期为 14 h—10 h。30 d后将幼苗取出，在叶片同一部位用牙签刺出伤口，加5 μL粗毒素后保湿（无菌棉）。设空白处理作为对照，每个处理重复3次，所有处理植株放于光照培养箱中，温度18 ℃，光照—黑暗比为 12 h—12 h。7 d后观察病斑。

1.4 粗毒素的组分鉴定

将提取出的粗毒素溶于正己烷中，定容至 1 mL。提取物用气质联用仪（江苏省农业科学院中心实验室）进行结构分析。具体条件如下：色谱柱为弹性石英毛细管柱TG-5MS;氦气（纯度99.999%）流速1 mL/min;进样口温度为280 ℃;采用不分流进样;升温程序如下：初始温度设置为 40 ℃，保持1 min，以6 ℃/min速度升温到280 ℃，保持2 min。

质谱条件设置如下：EI离子源，离子源温度为300 ℃;扫描范围（m/z）为40～550 amu，电子能量为70 eV。

2 结果与分析

2.1 粗毒素的提取与致病性鉴定

根据“1.2”节中提取方法，分别得到正丁醇和乙酸乙酯萃取的粗毒素。将上述提取出的粗毒素，分别滴加5 μL在G18的大蒜叶片伤口，4～7 d 后观察。从图1可以看出，病菌粗毒素对大蒜叶片有致病力，叶片接种后产生紫色条纹病斑，在伤口处则呈白色枯死病斑，后渐扩大呈椭圆形或条纹形，边缘有褪绿症状。从致病力分析，正丁醇萃取粗毒素的活性高于乙酸乙酯萃取粗毒素的活性。

2.2 粗毒素的组分鉴定

将提取出的粗毒素溶于正己烷中，定容至 1 mL。提取物用气质联用仪进行结构分析。获得样品的总离子图（图2）。共检出25种成分;通过质谱分析，从质谱图数据库中进行检索，最后鉴定得到4种成分。这4个成分分别鉴定为：2，4-二甲基庚烷、十一烷、3，5，5-三甲基-2-环己烯-1-酮、邻苯二甲酸丁基酯2-乙基己基酯（表1）。

3 讨论与结论

植物病原真菌毒素的研究较多，其中关于毒素的成分分析和结构鉴定是研究者关注的重要内容[11]。植物病原真菌毒素的分离纯化目前已有许多报道。韩珊采用柱层析和HPLC方法，对栗疫病病原菌寄生隐丛赤壳菌产生的毒素进行了分离纯化，得到Cp-Ⅰ、Cp-Ⅱ、Cp-Ⅲ毒素，其对板栗幼苗具有较高的致萎性[12]。郑露等对大蒜白斑病（匍柄霉属）病菌产生的毒素进行了分离纯化，通过综合应用质谱等方法鉴定发现其主要成分是SS-毒素[13]。陈夕军等通过气质联用（GC-MS）检测水稻纹枯病菌毒素，分析出该毒素的成分为葡萄糖等化合物[14]。

张林青等采用GC-MS法分析了大蒜白腐菌粗毒素化合物主要成分为酯类、有机酸类、醇类等物质，其中有致病性的毒素为月桂酸和邻苯二甲酸[11]。本研究与其不同之处是，采用有机溶剂提取大蒜白腐菌粗毒素。分别用正丁醇和乙酸乙酯萃取得到了大蒜白腐病菌粗毒素，采用气相色谱对粗毒素进行了物质组分分析。结果表明，用正丁醇提取的大蒜白腐病菌粗毒素活性高于用乙酸乙酯提取的，但二者均可引起大蒜叶片病斑产生，表明其提取物均具有生物活性。对粗毒素物质组分分析表明，仅有4种物质被鉴定，且与张林青等报道的物质无一相同。其中3，5，5-三甲基-2-环己烯-1-酮可通过食入、皮肤吸收、吸入等几种方式刺激黏膜、眼睛和皮肤，从而危害人体健康，人接触后有烦躁感觉[15-16]。另一化合物邻苯二甲酸丁基酯 2-乙基己基酯有报道称会引发动物的肝脏肿瘤，被认为可能是人类致癌物质之一[17]。

本研究在大蒜白腐病菌粗毒素提取和鉴定方面进行了探索，补充了大蒜白腐病菌粗毒素生物学活性及组分分析的研究内容，期望可为今后大蒜白腐病菌致病机理的研究和抗大蒜白腐病遗传育种提供理论参考。

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