血清miR-29a和miR-200b表达水平在预测三阴性乳腺癌患者预后中的临床价值

席晨辉

上海市嘉定区江桥医院/上海市第一人民医院嘉定分院普外科，上海 201803

乳腺癌作为对女性危害较大的恶性肿瘤，严重威胁女性健康，其发病率呈逐年增高的趋势。三阴性乳腺癌是一种特殊亚型的乳腺癌，主要病理特征为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER-2)均为阴性。三阴性乳腺癌的治疗手段较为单一，仅以化疗为主，缺少其他治疗措施；又因其容易出现其他脏器转移，所以五年生存率不足30%[1]，因此寻找新的治疗靶点十分必要[2]。微小RNA(miRNA)是近年来研究的热点，其在肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移中扮演重要角色，对肿瘤细胞的基因表达具有重要的调控作用，与多种肿瘤的发生、发展和预后均有关[3]。研究发现，在三阴性乳腺癌患者的血清中出现多种miRNA的异常表达，并且发现其对三阴性乳腺癌的病理生理过程具有调控作用，对三阴性乳腺癌的预后亦有重要影响，其中最具代表性的2种miRNA为微小RNA-29a(miR-29a)和微小RNA-200b(miR-200b)[4]。本研究对三阴性乳腺癌患者血清miR-29a和miR-200b表达水平进行检测，分析其在预测三阴性乳腺癌患者预后中的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年1月至2018年1月在本院确诊为三阴性乳腺癌并行乳腺癌根治术的女性患者98例为乳腺癌组，年龄35～79岁，平均(46.82±4.82)岁；已绝经者58例，未绝经者40例；病理分级：Ⅰ级23例，Ⅱ级63例，Ⅲ级12例；临床分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期34例，Ⅲ期38例，Ⅳ期9例；有淋巴结转移66例，无淋巴结转移32例；肿瘤最大径≤2 cm 39例，>2 cm 59例；Ki-67指数≤15% 26例，>15% 72例。选择同期在本院行乳腺良性肿块切除术的女性患者65例为乳腺良性肿块组，年龄33～76岁，平均(46.02±6.29)岁；已绝经者37例，未绝经者28例。纳入标准：患者均行病理诊断确诊为三阴性乳腺癌或者乳腺良性肿块。排除标准：合并其他类型的恶性肿瘤；合并血液疾病或免疫疾病；合并肝炎、结核和肺部感染等急慢性感染；术前经化疗、放疗和激素治疗；合并智力障碍或精神疾病。两组年龄、绝经情况等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象均签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1血液标本收集 患者于入院当日和手术后7 d抽取肘静脉血约5 mL，在室温下静置约20 min，然后以3 000 r/min离心10 min，离心半径为15 cm，取上清液约3 mL，放置在-80 ℃的冰箱中保存待测。

1.2.2实时荧光定量PCR检测血清miR-29a和miR-200b 总RNA的提取：取血清标本10 μL，采用总RNA提取试剂盒提取总RNA,采用紫外分光光度计(UV-3200型)测定标本的吸光度，吸光度设置范围为1.8～2.0。然后使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。由上海吉玛生物科技有限公司设计合成引物序列，miR-29a上游引物5′-ATGCACCTTCGAGCATTGT-3′，下游引物5′-TGTGCGTGTCTATATAC GA-3′；miR-200b上游引物5′-TGCCGTAATACTGCCTGGTAA-3′，下游引物5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′；内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。按照试剂盒说明书进行扩增，总反应体系：上、下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶2 μL，RNase-free ddH2O 4 μL，cDNA 2 μL，SYBR Green Mix 10 μL。循环扩增条件：95 ℃ 19 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 s，45个循环。以U6为参照，用2-ΔΔCt法计算miR-29a和miR-200b的表达水平。

1.2.3随访及分组 所有患者术后均随访3年。乳腺癌组在术后1个月、3个月、6个月、1年、2年及3年时进行全面检查[包括胸部CT、乳腺及腹部超声、头颅CT及癌胚抗原(CEA)、糖类抗原153(CA153)]，根据检查结果有无转移和(或)复发，分为预后不良组和预后良好组。乳腺良性肿块组在术后每6个月复查一次乳腺超声。

1.3观察指标 观察两组手术前后血清miR-29a和miR-200b表达水平的变化；分析三阴性乳腺癌患者术前血清miR-29a和miR-200b表达水平与临床指标及预后的关系；评价术前血清miR-29a和miR-200b表达水平预测三阴性乳腺癌预后的效能；分析三阴性乳腺癌患者术前血清miR-29a和miR-200b表达水平间的相关性。

2 结 果

2.1两组手术前后血清miR-29a和miR-200b表达水平比较 与乳腺良性肿块组比较，乳腺癌组术前血清miR-29a表达水平明显升高，miR-200b表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；乳腺癌组与乳腺良性肿块组术后血清miR-29a、miR-200b表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；乳腺癌组术后血清miR-29a表达水平低于术前，血清miR-200b表达水平高于术前，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组手术前后血清miR-29a和miR-200b表达水平比较

2.2三阴性乳腺癌患者术前血清miR-29a和miR-200b表达水平与临床指标的关系 术前血清miR-29a和miR-200b表达水平在不同肿瘤最大径、病理分级、临床分期和有无淋巴结转移患者间比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而在不同年龄、绝经状态和Ki-67指数患者间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 三阴性乳腺癌患者术前血清miR-29a和miR-200b表达水平与临床指标的关系

续表2 三阴性乳腺癌患者术前血清miR-29a和miR-200b表达水平与临床指标的关系

2.3术前血清miR-29a和miR-200b表达水平与三阴性乳腺癌患者预后的关系 经随访，预后不良组有33例，预后良好组有65例。预后不良组术前血清miR-29a表达水平明显高于预后良好组，miR-200b表达水平明显低于预后良好组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同预后三阴性乳腺癌患者术前血清miR-29a和

2.4术前血清miR-29a和miR-200b表达水平预测三阴性乳腺癌预后的效能 术前血清miR-29a和miR-200b联合检测预测三阴性乳腺癌预后的灵敏度为93.9%，特异度为81.5%，曲线下面积(AUC)为0.917，高于各项单独检测。见表4和图1。

表4 术前血清miR-29a和miR-200b表达水平预测三阴性乳腺癌预后的效能

图1 术前血清miR-29a和miR-200b单独及联合检测预测三阴性乳腺癌预后的ROC曲线

2.5三阴性乳腺癌患者术前血清miR-29a和miR-200b表达水平的相关性分析 三阴性乳腺癌患者术前血清miR-29a表达水平与miR-200b表达水平呈负相关(r=-0.687，P<0.05)。

3 讨 论

三阴性乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，占所有乳腺癌的15%～20%[1]。由于其侵袭性较强，容易发生脏器转移，且治疗手段较为单一，缺乏内分泌治疗和靶向治疗方法，因此预后较差，治疗后3年内复发率高达40%～50%[5]。如何改善三阴性乳腺癌患者的预后已经成为临床研究的热点[6]。miRNA作为一种非编码的单链小分子RNA，存在于各种肿瘤细胞中，其在基因转录的过程中具有重要的调控作用，能有效调控转录后的信息表达，参与细胞增殖、侵袭和转移过程。

本研究显示，乳腺癌组术前血清miR-29a表达水平明显高于乳腺良性肿块组，并且术后血清miR-29a表达水平较术前明显降低，说明血清miR-29a表达水平升高与三阴性乳腺癌的发生具有一定的联系，治疗后其水平下降。本研究还发现，三阴性乳腺癌患者术前血清miR-29a表达水平与肿瘤最大径、病理分级、临床分期和淋巴结转移情况有关，而与年龄、绝经状态和Ki-67指数无明显关系。肿瘤最大径越大、病理分级越高、临床分期越高及发生淋巴结转移的患者miR-29a表达水平就越高。现已知miR-29a位于人体7号染色体，具体定位为7q32.3，与肿瘤具有密切关系，在多种肿瘤中表现出抑癌因子的作用，如在胃癌[7]、前列腺癌[8]和胰腺癌[9]中呈低表达；然而miR-29a在乳腺癌和结肠癌中呈高表达，表现出促癌因子的作用，对肿瘤的发生、发展起促进作用[10]。研究显示，miR-29a在体外乳腺癌细胞中呈高表达，并且在发生转移的乳腺癌细胞中表达水平升高更明显，认为其与乳腺癌的发生、发展具有十分密切的关系[11]。本研究显示，三阴性乳腺癌预后不良患者术前血清miR-29a表达水平明显高于预后良好患者，说明血清miR-29a表达水平与三阴性乳腺癌的转移、复发具有密切关系。1项体外研究证实，转染miR-29a后，乳腺癌细胞的增殖和迁移能力明显增强，而阻断miR-29a表达后乳腺癌细胞的增殖和迁移能力明显减弱，说明miR-29a与乳腺癌细胞增殖和迁移有关[12]。本研究结果显示，当血清miR-29a取截断值为2.48时，其预测三阴性乳腺癌患者预后的灵敏度为81.8%，特异度为75.4%，AUC为0.820，具有较高的预测价值。

本研究中，术前血清miR-200b在乳腺癌组中的表达水平明显低于乳腺良性肿块组，且术后血清miR-200b表达水平较术前明显升高，说明血清miR-200b表达水平降低可能参与了乳腺癌的发生。现已知miR-200在多种恶性肿瘤(如肾癌、肺癌和卵巢癌)中的表达呈抑制状态，其可以通过调节内皮细胞间质化从而抑制肿瘤新生血管形成，阻断肿瘤细胞的增殖和迁移[13-14]。体外实验证实，在乳腺癌细胞中miR-200b呈低表达，并发现miR-200b可促进乳腺癌细胞凋亡，从而抑制乳腺癌进展[15]。本研究显示，三阴性乳腺癌患者术前血清miR-200b表达水平与肿瘤最大径、病理分级、临床分期和淋巴结转移情况有关，而与年龄、绝经状态和Ki-67指数无明显关系，肿瘤最大径越小、病理分级越低、临床分期越低及未发生淋巴结转移的患者miR-29a表达水平越高。本研究还显示，预后不良患者术前血清miR-200b表达水平明显低于预后良好患者，提示血清miR-200b表达水平与患者的预后有关。当血清miR-200b取截断值为1.08时，其预测三阴性乳腺癌患者预后的灵敏度为93.9%，特异度为70.8%，AUC为0.845，具有较高的预测价值。有研究显示，与正常乳腺组织比较，乳腺癌组织中miR-200b表达水平较低，且在体外抑制miR-200b表达后乳腺癌细胞的增殖和迁移能力明显增强[16-17]。本研究还显示，术前联合检测血清miR-29a和miR-200b预测三阴性乳腺癌患者预后的效能明显高于2项单独检测，联合检测具有更高的预测价值。相关性分析发现，三阴性乳腺癌患者术前血清miR-29a和miR-200b表达水平呈负相关(r=-0.687，P<0.05)，其具体机制仍需要进一步研究。

综上所述，血清miR-29a和miR-200b参与了三阴性乳腺癌的发生及发展，且与患者的预后有关，还可用于预后的预测，有望作为三阴性乳腺癌临床诊疗的新靶点。