产表面活性剂石油降解菌的筛选及其对石油烃的降解特性

孔萌，邢献杰，姜巧，彭明国，王晋，张文艺

(1.常州大学 环境与安全工程学院，江苏 常州 213164；2.中国石油化工股份有限公司金陵分公司，南京 210033)

随着工业化的迅速发展，石油的需求量大大增加，在石油开采、运输、储存等过程中，产生了大量的含油污泥。炼油厂在处理含油废水时产生的生化污泥、池底污泥和浮渣统称为“三泥”。炼油厂“三泥”主要是指由石油烃类、胶质、沥青质、泥沙、无机絮体、有机絮体以及水和其他有机物、无机物牢固黏结在一起的稳定乳化体系[1]，对土壤、地表水和地下水构成重大威胁，油气挥发更会影响空气质量。基于“三泥”对于环境的恶劣影响，含油污泥的无害化处理迫在眉睫。

目前，炼油厂“三泥”的处理方法主要有物理法、化学法和生物法[2]，其中，微生物修复技术由于成本低、效果好和无二次污染等特点受到广泛关注[3]。但石油烃的疏水性阻隔了其与微生物的接触，会在一定程度上减少微生物的修复效果[4]。为解决这一问题，往往会添加表面活性剂以起到增溶作用，由于其分子结构同时存在极性亲水基(如羟基、酰胺基、醚键等)和非极性疏水基(如烃链等)，因此，具有一定的表面活性，能有效降低水溶液的表面张力[5]，从而增大微生物与石油的接触程度，提高微生物降解效率[6]。其中，化学表面活性剂易产生二次污染和生物毒性，无法成为理想的表面活性添加剂。在一定条件下，部分微生物能代谢出一种次级产物表面活性剂[7]，因此，对于具有产生表面活性剂性能的石油降解菌的筛选及研究成为石油污染修复中的热点[8]。曹迪等[9]筛选出了具有高效降解石油烃能力和产生表面活性剂能力的菌株，在20 ℃下，第8天对石油烃的降解率可达64.98%。Zhou等[10]从油污土壤中分离出一株芽孢杆菌，发现其产生的脂肽类表面活性剂具有显著的降低表面张力和乳化性能。周敏等[11]筛选出了产脂肽类阴离子表面活性剂石油降解菌，试验结果发现，生物表面活性剂不仅可提高乳化性能，还可以促进石油降解菌的生长，提高石油降解率。笔者筛选得到的希瓦氏菌运用于石油降解的案例较少，刘芳明[12]曾筛选到一株南极低温降解菌NJ49，但与笔者研究不同的是，刘芳明并未证实其具有产生表面活性剂的特性。

笔者采用微生物法降解生化污泥和浮渣，从大庆油田含油污泥中筛选出4株菌，仅一株具有产表面活性剂的性能，命名为GJ，鉴定此产表面活性剂菌为希瓦氏菌属(Shewanellasp.)，并对其产物进行提取鉴定，分别运用Logistic模型、Luedeking-Piret模型和一级动力学模型对菌体生长、产物合成和降解石油过程进行动力学分析，进一步推断GJ降解石油烃的作用机制。

1 材料与方法

1.1 样品来源

菌株筛选自大庆油田的含油污泥。两种含油污泥来自南京金陵石化，分别为浮渣和生化污泥，其中，浮渣的含水率为57.14%，含油率为16.28%，含渣率为26.58%；生化污泥含水率为35.03%，含油率为8.50%，含渣率为56.47%。

1.2 培养基配方

肉汤蛋白胨培养基(LB)[13]用于分离纯化菌株；固体培养基是在LB基础上加20 g/L琼脂粉；无机盐培养基[14]用来降解含油污泥，由NaCl 1 g、(NH4)2SO44 g、K2HPO44 g、KH2PO44 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、微量元素 1 mL(CaCl2·2H2O 1 g、FeSO4·7H2O 1 g、EDTA 1.4 g)加蒸馏水至1 L，pH值调至6.5，121 ℃灭菌20 min；血平板培养基由酪蛋白胰酶消化物10.0 g、心胰酶消化物3.0 g、玉米淀粉1.0 g、琼脂14.0 g、肉胃酶消化物5.0 g、酵母浸出粉5.0 g、氯化钠5.0 g、羊血70 mL加蒸馏水至1 L配制而成，所用血平板培养基购于江门市凯林贸易有限公司。

1.3 产表面活性剂菌的筛选和鉴定

1.3.1 产表面活性剂石油降解菌的筛选 血平板筛选：取1 μL菌液滴在血平板上，25 ℃培养48 h，观察菌落周围是否有溶血圈[15]。

油扩散法测定排油活性：在直径9 cm的培养皿中倒入30 mL蒸馏水，滴入1 mL液体石蜡，待水面形成油膜后，向油膜中央滴入10 μL发酵液，测量排油圈直径[16]。

乳化性能表征：向比色管中加入3 mL正己烷和2 mL发酵液，剧烈晃动60 s后静置24 h，观察乳化层高度[17]。

(1)

1.3.2 菌种鉴定

1)生理生化鉴定：观察菌落的形态特征，参照《伯杰氏细菌分类鉴定手册》对细菌进行生理生化试验鉴定[18]。

2)菌株16S rDNA的鉴定：采用上海生工E2up柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，并进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成PCR产物纯化及测序。

1.3.3 表面活性剂的分离与提纯 将培养3 d的发酵液置于离心机中，以4 ℃、8 000 r/min的条件离心20 min，去除菌体。用6 mol/L HCl将上清液pH值调节为2.0，于4 ℃冰箱中静置24 h，观察是否有沉淀。如有沉淀，则表面活性剂可能有脂肽、脂蛋白存在；如无沉淀，则有可能存在糖脂[19]。取上清液加入等体积的乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、V氯仿∶V甲醇=2∶1、V氯仿∶V甲醇=1∶1，萃取2次，有机相合并并用无水NaSO4干燥，45 ℃旋转蒸发，得到的浅黄色浓稠物即为表面活性剂粗产物[20]。

将粗产物溶于0.05 mol/L的NaHCO3溶液中，过滤不溶杂质，用6 mol/L HCl调节pH值至2.0，置于离心机中，以4 ℃、9 000 r/min的条件离心15 min，收集沉淀，40 ℃烘干后即为纯化表面活性剂。

1.3.4 生物表面活性剂的鉴定 薄层层析(TLC)：取0.2 g上述粗产物溶于1 mL氯仿中，点样于硅胶G板，展开剂为三氯甲烷/甲醇/水(65/15/2，V∶V)，用不同的显色剂显色。

1)苯酚-硫酸显色剂：3 mL苯酚与5 mL浓硫酸溶于95 mL乙醇中，若显棕色斑点即存在糖脂，反之，无糖脂存在。

2)茚三酮显色剂：0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中，若显红色斑点即存在脂肽，反之，无脂肽存在。

3)钼酸铵-高氯酸显色剂：40 mg溴百里香酚蓝溶于100 mL 0.01%的NaOH溶液中，若显蓝紫色斑点即存在磷脂或类脂，反之，无磷脂或类脂存在[21-22]。

红外光谱扫描分析(FT-IR)：采用KBr压片法将上述纯化后的表面活性剂混合压成透明薄片后，使用红外光谱扫描分析测定[23]。

1.4 产表面活性剂生长动力学

取0.5 mL菌液培养至OD600为1，按5%的接种量接种至9.5 mL新配制的LB中，置于50 mL离心管中，纱布封口，置于振荡培养箱以25 ℃、150 r/min的条件培养，从第2小时开始每隔2 h取样，以空白培养基为参比，测量600 nm波长处的OD值[24]。

Logistic模型常用作描述有限环境下生物种群的S型增长[25]，使用Logistic方程拟合菌体生长曲线，见式(2)。

(2)

式中：y为x时刻的菌株细胞密度(OD600)；x为菌株生长时间，h；a为菌株最大浓度；k为细菌生长瞬时速率，h-1；b为模型参数。

1.5 表面活性剂合成动力学

使用Luedeking-Piret方程拟合菌体合成分泌表面活性剂的过程，见式(3)。

(3)

式中：P为表面活性剂产量，g/L；m1为非生长相关产物形成参数；m2为生长相关产物形成参数；X为最大细胞浓度(OD600)；t为发酵时间，h。

当m1=0、m2≠0时，产物形成于菌体生长阶段，为生长偶联型，产物直接来源于产能的初级代谢；当m1≠0、m2≠0时，产物形成于生长期和稳定期，产物形成与细胞生长部分偶联；当m1≠0、m2=0时，产物形成与细胞生长无关。

1.6 产表面活性剂菌对生化污泥的降解动力学

以5%的接种量将种子液接入19 mL降解培养基中，再加入0.1 g经研磨并过100目筛的均质化含油污泥，置于振荡培养箱中以150 r/min、25 ℃条件降解7 d，并设置3个平行对照，运用红外测油仪测定含油量，每天1次[26]。降解率由式(4)计算得到。

(4)

式中：w1为降解后测定含油量,mg；w2为降解前测定的含油量,mg。

对生化污泥和浮渣进行降解，通过动力学曲线来比较降解过程中的变化，一级反应方程式见式(5)。

(5)

式(5)两边积分可得式(6)。

lnS=-kt+lnS0

(6)

式中：S为含油污泥t时刻的含油率，%；t为时间，d；k为一级反应速率常数，d-1；S0为含油污泥初始含油率，%。

2 结果与讨论

2.1 产表面活性剂菌的筛选和鉴定

2.1.1 产表面活性剂菌的分离纯化 从大庆油田含油污泥中分离纯化出4株产表面活性剂菌，用血平板进行初筛后，获得1株菌在血平板上产生明显溶血圈，命名为GJ，但血平板溶血现象也有可能由产溶血酶菌产生，易混淆[27]，还需进一步鉴定，因此，保留另外3株排油直径大于3 cm的菌株，分别命名为CJ、BJ、TJ，以进行进一步研究。

表1是油扩散法和乳化性能复筛结果。由表1可以发现，GJ的排油活性及乳化性能明显高于其他菌株，因此，选择GJ作为目标菌株。观察菌株培养特征和形态特征，GJ菌落较大，为扁平、光滑、半透明、淡粉色菌落。其部分生理生化特性见表2。

表1 细菌复筛结果Table 1 Bacterial screening results

表2 菌株GJ的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of GJ

通过测序，获得的序列输入Gene Bank后，利用BLAST对比分析同源性并绘制系统发育树。如图1所示，GJ菌在分子系统发育分类上属于希瓦氏菌属(Shewanellasp.)，与GJ最近缘的菌株是ShewanellaputrefaciensstrainFDAARGOS_681 (CP046329.1:771993-773358)，核苷酸同源性为100%。

图1 GJ菌株16S rDNA基因序列系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of GJ

2.1.2 产表面活性剂菌生长动力学、产物合成动力学 图2为GJ菌株的生长动力学模型。由图2可知，GJ菌在46 h时菌浓度达到最大。2 h后进入对数生长期，此时营养充足，生长迅速；28 h后进入稳定期，由于前期长势迅猛，营养物质消耗较快，46 h后便进入衰亡期[28]。

利用Origin 9.0软件，根据试验数据对Logistic方程进行非线性拟合，求解方程中的参数，a为1.580 5，b为6.959 8，k为0.144 9，此模型的拟合程度良好(R2=0.971 8)，说明Logistic模型可以较好地描述GJ菌体生长的情况。

根据GJ菌株生长曲线和表面活性剂产量曲线的变化趋势，发现生长期和稳定期都在进行表面活性剂的合成，此过程为部分生长偶联型。因此，Luedeking-Piret方程可变为

P=aX+K

(7)

如图2所示，将P与X进行线性拟合，得到P=0.120 5X-0.481 0，R2=0.984 8。

图2 GJ动力学方程模拟曲线Fig.2 GJ dynamics equation simulation

2.2 表面活性剂的提取、纯化及鉴定

发酵液离心后所得上清液用6 mol/L HCl调节pH值至2.0，置于4 ℃冰箱中静置24 h后未产生沉淀，说明产物中没有脂肽、脂蛋白存在，初步鉴定产生的表面活性剂为糖脂类物质。薄层层析分析显示，GJ菌产物在苯酚-硫酸显色剂下显棕色，加入其他显色剂均无明显变化。这说明GJ菌主要产糖脂类表面活性剂，不产生或者产生较少的脂肽类、磷脂类物质。将GJ菌株产物提纯，用红外光谱仪分析物质结构，结果见图3。3 433.24 cm-1波段吸收峰为—OH伸缩振动；2 926.16 cm-1处的吸收峰为糖类分子中C—H键的伸缩振动，表明产物中含饱和脂肪链；1 639.59 cm-1处是C=O双键的伸缩振动，表明存在饱和脂肪链；1 458.76 cm-1处为脂肪族肽链上C—H键的变角振动吸收峰，—CH3和—CH2表明存在烷烃的链状结构；1 093.46 cm-1处的吸收峰归属于C—O—C键的伸缩振动，为酯类吸收峰，说明分子中存在一个五元环内酯结构和糖苷键，进一步证实了GJ菌的产物为糖脂类表面活性剂。

图3 GJ菌产物红外光谱Fig.3 Infrared spectrogram of strain GJ

2.3 产表面活性剂菌对含油污泥的降解动力学

在降解培养基中将GJ分别用于降解浮渣和生化污泥，每天测定菌株对含油污泥的降解率。如图4所示，GJ对浮渣和生化污泥均有较好的降解效果，浮渣的最终降解率为81.11%，生化污泥的降解率最终达到83.21%。GJ对生化污泥的降解速率呈先快后慢的状态，对浮渣则呈先慢后快的状态。推测GJ在含油量较低的环境下代谢更加活跃，能在较短时间内合成分泌出表面活性剂。而处于含油量较高的环境中时，由于含油污泥稳定的油包水或水包油结构，微生物与石油烃间存在油水界面，导致微生物难以摄取石油烃作为碳源供给自身代谢，需要更长时间来适应较高含油量的环境。之后分泌表面活性剂增大含油污泥乳化程度，从而增大微生物与石油烃的接触程度，进一步对石油烃进行摄取和分解，最终达到降低含油量的目的。

图4 菌株GJ对生化污泥和浮渣的降解率Fig.4 Degradation rate of biochemical sludge and scum by strain

图5为菌株GJ降解生化污泥和浮渣过程中污泥含油率的变化，含油量逐渐减少，基本呈由慢到快再变慢的状态，最终菌株GJ降解后的生化污泥含油率为1.61%，浮渣含油率为2.73%。

图5 GJ作用下污泥含油率的变化Fig.5 Change of sludge oil content under the action of

图6为lnS与t的拟合结果。根据石油烃降解一级反应动力学拟合结果可知，菌株GJ降解生化污泥的一级动力学方程为S=e-0.315 2t+2.561 8；降解浮渣的一级动力学方程为S=e-0.281 6t+2.706 4。此外，一级动力学模型曲线与菌株GJ降解过程中生化污泥和浮渣含油量的变化拟合度较好，菌株GJ降解生化污泥和浮渣动力学模型的相关系数分别为R2=0.963 1和R2=0.890 6。在降解含油污泥过程中，菌株GJ对含油污泥的降解变化基本遵循一级反应动力学。

图6 菌株GJ降解含油污泥动力学模型Fig.6 Kinetic model for degradation of oily

2.4 产表面活性剂菌降解含油污泥机理分析

表面活性剂在产表面活性剂菌降解石油烃的过程中有重要作用，含油污泥是稳定的油包水或水包油的乳化体系，微生物与石油烃之间存在稳定的油水界面，导致微生物能接触到的石油烃十分有限，因此，以石油烃为唯一碳源的产表面活性剂菌能摄取到的石油烃极少，这也是产表面活性剂菌在降解初期效率较低的主要原因。产表面活性剂菌生长代谢过程中合成分泌出表面活性剂并排到胞外，打破油水界面，与石油烃进行增溶反应，大幅增加微生物与石油烃的接触程度，从而能摄取石油烃并进行解离，通过活动代谢最终转化为小分子有机物、CO2和H2O[29-30]，同时，又继续合成分泌出表面活性剂，整个过程循环进行，这也是降解中期效果明显的原因。GJ菌摄取、降解石油烃的作用机制如图7所示。

图7 GJ菌摄取、降解石油烃作用机制推测Fig.7 Speculation on the mechanism of GJ bacteria uptake and degradation of petroleum

3 结论

1)从大庆油田含油污泥中筛选出1株既产表面活性剂又能降解石油烃的菌株GJ，为革兰氏阴性菌，属于希瓦氏菌属(Shewanellasp.)，菌株GJ呈“S”型生长，能与Logistic生长方程较好拟合。

2)薄层层析法和红外光谱分析鉴定GJ的产物中存在一个五元环内酯结构和糖苷键，证明GJ的产物为糖脂类表面活性剂。运用Luedeking-Piret方程拟合菌体合成分泌表面活性剂的情况，所得动力学方程可较好地模拟GJ分泌表面活性剂的过程。GJ对浮渣和生化污泥中的石油烃均有较好的降解效果，降解率分别为81.11%和83.21%，降解动力学均符合一级反应动力学方程式。

3)初步推断GJ菌摄取、降解石油烃的作用机制为：菌株GJ是以石油烃作为碳源的微生物，在生长过程中分泌次级产物为表面活性剂，表面活性剂打破油水界面，增大菌株与石油烃的接触程度，从而能摄取石油烃并进行解离，促进对石油烃的摄取、代谢及增殖。代谢产物最终转化为小分子有机物、CO2和H2O，同时，又继续合成分泌出新的表面活性物质，整个代谢过程循环进行。