水产品中甲基睾酮残留检测方法研究进展

◎ 郑 蓉，张 娟，姜美勤

（钛和检测认证集团股份有限公司，上海 200060）

食品安全与人们的身体健康密切相关。但是，在水产养殖中，为了防治各种疾病、缩短养殖周期、追求产量，存在不合理用药、违禁使用药物的问题，造成水产品中抗生素残留超标，还出现了为防治水霉病而使用孔雀石绿的事件以及“3·15”曝光的海参除草剂事件等，因此中华人民共和国农业农村部对我国的食品安全问题也日益重视。

人工合成的类固醇药物甲基睾酮（Methyltestosterone，MT），呈白色或乳白色结晶性粉末，具有雄性和蛋白同化双重作用。在水产养殖中，苗种培育和性别控制的特效药物之一——甲基睾酮，受到养殖户的青睐[1]。但摄入含有甲基睾酮残留的水产品会对人体健康产生危害，可能会造成人体激素水平失衡，肝中毒、胎体中毒等。我国国家标准中已明确规定，禁止使用甲基睾酮等激素类药物作为动物培育的“性诱导剂”，在水产品中不得检出甲基睾酮，因此对水产品中甲基睾酮残留检测方法的研究在食品安全行业中必不可少。本文概述了甲基睾酮的作用机制、危害和相关法规标准，针对水产品中甲基睾酮的前处理方法和检测技术进行了系统综述，并分析了未来需要解决的技术挑战，对今后的研究进行了展望，旨在为水产品中甲基睾酮残留检测和监管提供技术提供参考。

1 甲基睾酮概述

1.1 甲基睾酮的机理

甲基睾酮又叫甲基睾丸素和甲睾酮，是一种蛋白同化雄性激素。在水产养殖中，甲基睾酮曾一度被用于苗种培育和性别控制，主要是为了增强受体的雄性体性、提高养殖产量等[2]。这是因为甲基睾酮可以促进线粒体的生物合成和质量控制，通过促进红细胞生成和加强毛细血管来增加组织的净氧输送，使得动物体内蛋白合成和肌肉增长的速率加快，其主要通过影响鱼体的性类固醇激素含量，如雌二醇、睾酮等水平进而诱导雌鱼雄性化，也可通过影响硬骨鱼类性别分化相关基因的表达，来达到控制性别的目的[3]。甲基睾酮的生长促进作用与生长激素的代谢升高有关。

由于甲基睾酮的特殊作用，在水产养殖过程中会存在违法使用甲基睾酮的行为。据报道，不同含量的甲基睾酮对鱼类生长、代谢和发育等生理过程具有不同程度的影响。目前已有报到，甲基睾酮成功诱导了罗非鱼（Oreochromis mossambicus）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、点带石斑鱼（Epinephelus coioides）等多种鱼类发生性逆转，研究发现用含有 50 mg·kg-1和 100 mg·kg-117α- 甲 基 睾 酮 的 饲 料投喂出膜后15 d的大口黑鲈60 d，均获得100%的雄 性率[4]。 研究表明，用 0 mg·kg-1、100 mg·kg-1和250 mg·kg-1浓度的甲基睾酮处理中国对虾（Fenneropenaeus chinensis），发现不同组之间没有显著差异，然而在500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1的高剂量下，东方河对虾生长性能显著增强，但是性腺发育延迟，这与之前的研究一致，即快速性腺发育会对水生物种的生长性能产生负面影响[5]。穆迎春等[6]研究发现，低浓度的甲基睾酮对鱼类的生长具有促进作用，而高浓度则会产生抑制作用，浓度为1～5 mg·L-1可促进金鱼和鲤鱼生长；浓度为10～50 mg·L-1会导致金鱼或罗非鱼由雌性向雄性完全逆转；浓度为100 mg·L-1以上可使异育银鲫变为中性不育鱼。因此，甲基睾酮的使用量非常关键，会对水产养殖产生不同的影响。

1.2 甲基睾酮残留的危害

甲基睾酮被作为一种性激素和强壮剂添加到饲料中时，虽然具有增加水产品产量和控制性别等优势，但是这类激素在动物体内代谢缓慢、不易分解，当人体食用含有甲基睾酮残留的水产品时会对自身身体健康造成巨大危害，导致肝中毒或其他重要组织器官发生生理病变，甚至具有潜在的致畸、致癌、致突变性。有研究表明，甲基睾酮代谢时间长，对人类的危害是慢性、长期和累积性的。甲基睾酮的危害主要表现在痕量残留会干扰人体内自然激素的平衡，导致正常人生理功能紊乱，还可能造成女性消费者出现痤疮、多毛、声音变粗、闭经、乳腺退化和性欲改变等男性化现象，甚至对新生儿有致畸作用，干扰肝内毛细胆管的排泄功能，引起胆汁郁积性黄疸，影响儿童的正常生长发育[7]。

目前，不少国家已经禁止在水产品养殖中使用此种激素，并要求水产品中不得检出该激素。欧盟和美国都规定在养殖中不允许使用甲基睾酮等性激素类药物，中国在《无公害食品 水产品中渔药残留限量》（NY 5070—2002）中将甲基睾酮明确列为禁用药物，中华人民共和国农业农村部发布的235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中也规定甲基睾酮为禁用兽药。

2 检测样品前处理方法

针对甲基睾酮的残留检测，其样品前处理的主要步骤包括用有机试剂进行提取、溶液浓缩和净化等。因水产品组分复杂，含有大量蛋白和脂肪，且有些成分与甲基睾酮在结构和理化性质上都相似，前处理步骤在整个检测过程中至关重要。提取是通过化学或物理方法从物质中制取有用成分，一般是在确保待测组分的最大提取率和减少样品基质中杂质的基础上选择提取方法和溶剂。优异的净化条件能够降低基质效应、提高方法灵敏度、保证净化效果和回收率，因此不同基质样品需要采用不同的净化方法。甲基睾酮检测常用的前处理方法有液-液萃取技术（Liquid–Liquid Extraction，LLE）、 固 相 萃 取 技 术（Soild Phase Extraction，SPE）等[8]。样品中甲基睾酮检测的样品前处理方法见表1。

2.1 液-液萃取技术

LLE是利用混合物中各组分在两种不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离目的，通常采用漏斗振荡或涡旋萃取两种方式。激素类药物残留分析中常用的提取溶剂有甲醇、乙腈、丙酮、乙醚和乙酸乙酯等。基于溶剂自身特性和样品基质来说，甲醇、乙腈和丙酮易与样品结合，提取速度快；乙醚和乙酸乙酯适于提取脂溶性化合物[8]。乙腈是甲基睾酮残留检测常用的有机溶剂，可将被测组分从大量内源性物质中分离出来，具有沉淀蛋白的作用，可减少杂质对测定结果的干扰。中华人民共和国农业部发布的行业标准《水产品中甲基睾酮残留量的测定 液相色谱法》（SC/T 3029－2006）中采用的提取方式就是用大量的石油醚和乙腈进行液液萃取，由于液液萃取操作步骤烦琐、成本高、需要消耗大量的有机溶剂，后期的很多研究都在选取优化的萃取方式[14]。

2.2 固相萃取技术

在农药残留检测中，SPE是经常会使用到的一种净化方法，可采用不用类型的固相萃取柱净化样品，该方法利用目标物与吸附剂之间的作用力来保留或吸附的原理，确保达到分离效果。黄鸾玉等[10]比较 了 ODS-C18柱（200 mg/3 mL） 和 poly-sery HLB（60 mg/3 mL）对水产样品提取液的净化效果，结果表明C18柱回收率低于50%，HLB柱回收率可达90%，因此选择HLB柱净化样品。李佩佩等[11]建立了水产品中甲基睾酮残留的高效液相色谱的测定方法，在样品前处理阶段选择LC-C18柱进行净化实验，结果表明该方法在7.0～200 μg·kg-1添加范围内的平均回收率为82.0%～86.0%。万译文等[12]选择了4种不同的固相萃取柱（C18500 mg/3 mL、HLB60 mg/3 mL、Alumina-N 60 mg/3 mL和 PCX 60 mg/3 mL）比较对甲基睾酮的净化效果，最后选择了Alumina-N中性氧化铝柱（60 mg/3 mL），此固相萃取-高效液相色谱法步骤简单，净化效果好。

3 甲基睾酮的检测方法

目前，国内外对水产品中甲基睾酮残留检测方法进行了相应的研究和报导，研究较多的主要有高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[13]、气相色谱-质谱联用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）法[14-16]、液相色谱-串联质谱法（Liquid Chromatography Tandem mass Spectrometry，LC-MS/MS）[17-19]、酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）[20]、毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis，CE）[21]和化学发光法[22]。水产品中甲基睾酮检测方法比较见表2。

表2 水产品中甲基睾酮检测方法比较表

3.1 高效液相色谱法

色谱法是在甲基睾酮检测中应用较为普遍的一种方法，其检测的准确度和灵敏度较高，主要包括液相色谱和气相色谱，SC/T 3029－2006就明确了使用液相色谱的方法。近些年来通过对此检测方法应用发现，此方法样品处理步骤繁多，检测限较高，为10 μg·kg-1；回收率低于70%，不适合用于批量检测，需要对其进行进一步的改良。陈培基等[23]在《水产品中甲基睾酮残留量的测定 液相色谱法》（SC/T 3029－2006）标准的基础上，改进了样品前处理和色谱条件，建立了测定甲基睾酮的高效液相色谱条件。彭家杰等[24]研究优化了高效液相色谱法中的样品转移操作、浓缩和净化流程、色谱条件等，使回收率和工作效率都得到了提高。黄鸾玉等[10]通过优化提取净化方法，建立了超高效液相色谱分析方法，检出限为5.0 μg·kg-1，提高了工作效率，减少了试剂消耗量。

3.2 色谱与质谱联用法

色谱-质谱联用分析法是有机物定性、定量分析的有利工具。REGAL等[25]采用液质联用的方法（LC-MS）测定甲基睾酮的含量，发现该方法的检测限小于5.0 μg·kg-1，有效提高了测定的灵敏度与准确度。罗柏华[26]建立了液相色谱－电喷雾串联质谱测定的方法，该方法的定量限范围为0.1 μg·L-1；杨霄等[27]建立了分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中甲基睾酮残留量的方法，结果发现甲基睾酮在1～200 ng·mL-1线性关系良好，方法的检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为 1.0 μg·kg-1，用该法对罗非鱼、中华鳖、凡纳滨对虾进行3个水平的加标回收试验，回收率为82.4%～96.3%，相对标准偏差均不大于6.98%。

3.3 免疫分析学方法

免疫分析法是利用毒物与标记毒物竞争性结合抗体检测毒物的方法，适合于复杂基质中痕量组分的分析。DAZKIEWICZ等[28]报道了测定鱼饲料和猪饲料中甲基睾酮的残留方法为直接竞争性酶联免疫方法和胶体金免疫层析法，其检测结果与气相色谱-质谱分析方法结果一致，说明该法可广泛应用于甲基睾酮的残留检测。LUA等[29]建立了牛尿中甲基睾酮的酶联免疫检测法，检测限为266 pg·mL-1。王强等[30]建立了间接竞争酶联免疫吸附法（ELISA）测定水产品中甲基睾酮残留，发现该方法的抑制中浓度IC50为3.48 μg·L-1。夏武强等[31]通过胶体金标免疫层析技术（Goldimmunochromatographicas Say，GICA） 建 立了甲基睾酮快速测试方法，将待测样品中的甲基睾酮和试纸条检测线上包被的人工抗原甲基睾酮偶联抗原（MT-BSA）竞争性结合金标结合垫上包被的胶体金-甲基睾酮单抗聚合物，根据检测线呈现的红色线条深浅来判定样品的阴阳性，发现测试时间仅需10～15 min，试纸条的最低检测限达到10 μg·kg-1。

3.4 其他检测技术

除了高效液相色谱法、色谱与质谱联用法、免疫分析学方法之外，还有毛细管电泳-紫外检测法（检出限1 μg·mL-1）、化学发光检测法等其他检测方法。

4 结语

甲基睾酮是一种人工合成的雄性激素，添加在水产品的饲料中可以提高饲料转化率，促进蛋白质合成，提高动物生长速率。但是甲基睾酮代谢缓慢，蓄积性强，通过食物链进入人体会产生严重的副作用，因此对甲基睾酮残留检测就显得尤为重要。目前国内关于高效准确检测甲基睾酮在水产品中残留的研究尚不完善，有待于进一步的开发和探索。对于甲基睾酮的前处理方法，相较于的行业标准SC/T 3029—2006中液-液萃取技术，现在更常用的是能减少溶剂消耗，有效降低样品基质效应的固相萃取技术。目前对于检测方法的研究主要有高效液相色谱法，该方法使用仪器价格适中，检测的准确度和灵敏度较高，可满足日常检测的需要，但是前处理步骤复杂、耗时长、不适合批量检测；液相色谱-串联质谱法前处理方法简单、能快速检测水中激素残留，但是仪器价格昂贵；气相色谱-质谱法具有灵敏度高、试验数据可靠等优点，但需要对分析物进行衍生化，结果不稳定；酶联免疫吸附法是公认的操作简便、快速的检测方法，具有特异性强、灵敏、简便、准确和样品通量高等优点，但缺点是无法精准定性定量，只能用作初步筛查。时代发展对药物残留相应的配套检测技术提出了快速、准确的要求。因此探索前处理方法简便、自动化程度高的检测技术用于水产品中甲基睾酮残留检测，将具有较为广阔的应用前景。