基于DNA条码技术的高通量食品中动物源性 成分的快速检测方法

张先茂，颜庭林

（甘肃省产品质量监督检验研究院，甘肃兰州 730050）

DNA条形码技术是近年来新兴的DNA分子检测技术[1]。不同于传统的分子检测技术，DNA条形码以一对通用引物扩增物质的线粒体基因COI标准序列，通过序列内碱基的多样性对已知和未知的成分进行识别，且这种技术已逐渐应用于食品领域[2]。在动物源性食品中，线粒体基因COI已成为动物物种鉴定中公认的理想DNA条形码片段。由于DNA分子的热稳定性，DNA条码技术在加工肉类食品中鉴定动物源性成分、标签符合性查验等方面被广泛应用[3-5]。

目前对肉类加工食品中未知动物源性成分的检验还处于空白阶段，传统的Sanger测序技术仅能对已知动物源性成分进行检验，在对多种未知动物源性成分的检验方面还存在不足。本实验应用DNA条码技术，结合纳米技术，开发能快速、准确检测食品中动物源性成分的检验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

动物源性食品来源：熟制牛肉、熟制羊肉、熟制鸭肉、熟制鸡肉、熟制猪肉和熟制牦牛肉购自兰州某大型超市，-18 ℃保存；熟制马肉购自甘南藏区。

1.2 试剂

动物源性成分DNA提取试剂盒（天根生物科技有限公司，包括DNA裂解液；PCR缓冲液 10X；dNTP 10X；Tap酶5 U/µL）；琼脂 糖（Sigma）；GEL-Red（碧云天生物科技有限公司， 10000X）。

1.3 设备

PCR仪（美国伯乐，T100）；水平电泳仪（美国伯乐，PowrpacBasic）；凝胶成像系统（美国伯乐，GEL DOCXR）；荧光定量PCR仪（美国赛默飞，QuantStudio）；核酸蛋白测定仪（美国赛默飞，Nanodrop one）；组织破碎仪（格兰迪森，GD-IN）。

1.4 实验方法

1.4.1 引物探针设计

应用PrimerBank，结合VALENTINI等[6]的方法，设计牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉和猪肉的通用引物，引物探针序列如表1所示。

表1 引物探针序列

1.4.2 样本DNA提取及质量检测

根据试剂盒说明书步骤提取动物源性食品样品DNA。提取纯化后的DNA溶液为10 µL，取0.2 µL到核酸蛋白测定仪中测定纯度，核酸纯度控制在70～120 ng/µL[7]。

1.4.3 高通量DNA条码技术的建立

与赛默飞生物科技有限公司合作，将设计的通用内参基因序列，F＇端通用引物，R＇端通用引物，探针引物固定在荧光实时定量PCR仪器配套的微流控芯片上。将纯化后浓度为70～120 ng/µL的核酸，牛、羊、鸭、鸡、猪DNA滴加在荧光实时PCR微流控芯片上[8]。通过优化实验，最终确定多重实时荧光PCR反应最优条件见表2。

表2 实时荧光PCR反应体系

1.4.4 方法特异性及检出限

取同样质量的牛、羊、鸭、鸡、猪、马和牦牛动物源性样品，用组织破碎仪打碎，混匀，按照1.4.2的方法提取DNA，对混合样品进行多重实时荧光PCR扩增，根据扩增荧光曲线，检测通用引物扩增的特异性[9]。

将牛、羊、鸭、鸡和猪的模板样品的DNA进行10倍梯度稀释，原始DNA浓度为100 ng/µL，稀释后浓度分别为10.00 ng/µL、1.00 ng/µL、0.10 ng/µL和0.01 ng/µL。多重实时荧光PCR扩增后，检测牛、羊、鸭、鸡和猪的模板样品DNA的最低检出限。

2 结果与分析

2.1 DNA提取质量及纯度检测结果

按照1.4.2实验方法提取样品中DNA，用核酸蛋白分析仪测定核酸浓度。如表3所示，所有样品DNA提取效果较好，DNA浓度在150～270 ng/µL，需要对DNA浓度进行适当稀释，控制DNA浓度在70～120 ng/µL。

表3 提取的DNA浓度

2.2 多重DNA条码扩增结果

根据通用引物和探针扩增牛、羊、鸡、鸭和猪样品，通过优化PCR条件，最终被检测样品均扩增出明亮、无拖尾的特征性目的条带，说明该方法可以同时检测5种样品，且无干扰条带。扩增出的片段，牛源性样品为274 bp，羊源性样品为331 bp，鸡源性样品为227 bp，鸭源性样品为201 bp，猪源性样品为398 bp。扩增产物电泳图见图1。

图1 多重DNA条码扩增结果

2.3 特异性和检出限检测结果

在已知样品中混入马、牦牛动物源性物质，根据多重动物源性样品多重实时荧光扩增结果，马动物源性食品应用通用引物扩增，扩增不出荧光条带，说明该方法研究的通用引物具有特异性。如图2所示，1号为空白，2号为马肉，显示无扩增产物。3号、4号分别为牛、牦牛，说明该引物对同源相似性大的动物源性食品均有扩增效果。5～8号分别为羊、鸡、鸭、猪源性食品，均有很好的荧光扩增曲线。取牛、羊、鸡、鸭和猪的模板样品，混合打碎后提取纯化DNA，经梯度稀释后，混合样品DNA浓度依次为100.00 ng/µL、10.00 ng/µL、1.00 ng/µL、 0.10 ng/µL和0.01 ng/µL。经多重实时荧光PCR扩增后，结果如图3所示，1号为DNA浓度100.00 ng/µL，2号 为DNA浓 度10.00 ng/µL，3号 为DNA浓 度 1.00 ng/µL，4号 为DNA浓 度0.10 ng/µL，5号 为DNA浓度0.01 ng/µL，6号为空白。DNA浓度为0.01 ng/µL时，无扩增荧光曲线，表明DNA浓度过低，不能有效扩增。最低DNA浓度为0.10 ng/µL时有荧光扩增曲线，表明该方法能检测到的最低DNA浓度为 0.10 ng/µL，该方法的检出限为0.10 ng/µL。

图2 样品多重实时荧光PCR扩增曲线

图3 样品浓度梯度多重PCR扩增曲线

3 结论

该方法研究应用DNA分子标记技术，开发通用引物探针，快速检测牛、羊、鸡、鸭和猪5种混合样品中每类样品的含量，该检验方法能检测DNA的最低浓度为0.10 ng/µL，方法检出限为0.10 ng/µL，该灵敏度满足国家标准检测动物源性成分标准要求。