温度与培养基对青梅菌菌丝生长的影响研究

管芩澜，龚明福

（乐山师范学院 生命科学学院，四川 乐山 614004）

0 引言

青梅(Prunus mume(Sieb.) Sieb.et zucc.)，又称为酸梅、果梅，为蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)植物，主要分布于中国、日本、韩国、朝鲜、泰国等亚洲国家以及欧洲及美国等地。我国是青梅的原产地及世界上适合生产青梅地域最广的国家，广东、广西、四川、浙江、江苏、福建及台湾等18 个省（自治区）均适合生产。青梅不仅营养丰富[2-3]，还具有独特的药用价值[4-8]，中国古代药典均有着青梅的诸多药用记载。目前对青梅的研究主要集中于青梅种质资源开发[9-10]、栽培技术[11]、加工产品[12-14]、病虫害防治[15-17]等方面，对青梅的菌根真菌研究鲜见报道。项目组通过近三年对马边县三河口镇青梅林的观察和了解，发现青梅菌只能生长在青梅林下，并且青梅菌子实体仅在4 月上旬到5月上旬出现（土壤温度13～18 ℃）。

青梅菌，是青梅的一种外生菌根真菌，学名为晶盖粉褶菌（Entoloma clypeatum），隶属于担子菌门(Basidiomycota)，层菌纲(Hymenomycet)，伞菌目(Agaricales)，粉褶菌科(Entolomataceae) 粉褶菌属（Entoloma(Fr.) P.Kumm.），能够与蔷薇科的蔷薇属、梨属、李属、海棠属等植物形成外生菌根[18-20]。青梅菌作为粉褶菌属成员之一，在食用和医疗具有较高的经济价值[21-23]。我国对粉褶菌属真菌的研究主要集中在分类上，对粉褶菌进行分离培养和人工栽培方面的研究未见报道，国外学者从组织中和通过担孢子分离获得了晶盖粉褶菌的遗传多样性的菌株[24-28]，并回接杜梨获得子实体[29]。

菌根真菌是一类能够与木本植物共生形成外生菌根的大型真菌，中国已经发现的可食用菌根真菌有677 种，占食用菌种类70%[22]。由于菌根真菌生长的特殊性，一直以来没有得到人类的重视。除松口蘑、红菇等少数菌根菌被开发利用外，大多数都任其自生自灭，青梅菌目前仍处于这样的状态。

因此，栽培青梅菌的价值与意义十分重大。本研究拟通过人工分离获得青梅菌菌丝体，研究青梅菌菌丝生长所需要的营养条件和温度需求，为青梅菌的半人工栽培和人工栽培提供理论基础和技术保障。

1 材料与方法

1.1 培养基

青梅菌菌丝体分离和培养用PDA 培养基。

青梅菌原种培养采用的培养基配方如下：基础配方为麸皮10%，石灰1%，石膏1%，供试材料为玉米粒、玉米渣、棉籽壳、木屑和麦粒，添加量均为88%。

1.2 青梅菌菌丝的分离与纯化

青梅菌子实体于2020 年4 月5 日采集自四川省乐山市马边彝族自治县三河口乡王家觉坝村（经度103.352°，纬度28.894°，海拔：1 228.54 m），气温16 ℃，土壤温度14 ℃（见图1、图2）。

图1 青梅菌子实体采集地点

图2 青梅菌生长环境

采集到的青梅菌子实体当日送到实验室，依次用75%的乙醇和5%的次氯酸钠进行表面消毒，用无菌解剖刀去除消毒后的表皮后，用无菌解剖针挑取黄豆粒大小的组织块，接种于PDA平板上，25 ℃恒温避光培养3～5d[30]，取生长良好、无杂菌污染的菌丝在PDA 平板上进一步纯化获得青梅菌纯培养[31-32]，保存于PDA 斜面备用。

1.3 温度对青梅菌母种菌丝生长的影响

用无菌打孔器将培养在PDA 平板上青梅菌菌丝体打成圆形菌饼（直径7 mm），用解剖针将青梅菌菌饼接种到新鲜的PDA 平板中央，分别放置在11 ℃、17 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃的恒温培养箱中培养7 d，测定菌落直径，计算青梅菌母种菌丝日均生长速率。

1.4 温度对青梅菌原种菌丝生长的影响

采用棉籽壳培养基，按配方配好料后，分装到100 mL 的组培瓶中，每瓶分装2/3 体积，121 ℃40 min 灭菌，冷却后接入青梅菌母种，分别放置在17 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃的恒温培养箱中培养10 d，测定菌丝生长长度，计算青梅菌原种日均生长速率。

1.5 培养基对青梅菌原种菌丝生长的影响

采用玉米粒、玉米渣、棉籽壳、木屑和麦粒为主粒的5 种培养基配方，配方见1.1。各配方培养基按配方配好料后，分装到100 mL 的组培瓶中，每瓶分装三分之二体积，121 ℃40 min灭菌，冷却后接入青梅菌母种，25 ℃培养10 d，测定菌丝生长长度，计算青梅菌原种日均生长速率。

2 结果与分析

2.1 青梅菌母种菌丝的分离与纯化

用组织块无菌分离法获得青梅菌母种菌丝体（见图3）。

图3 青梅菌母种

2.2 温度对青梅菌母种菌丝生长的影响

青梅菌母种菌丝在不同温度下的日均生长速率见表1。由表1 可以看出，随着温度升高，青梅菌菌丝生长在22 ℃以下逐渐加快，在22 ℃以上逐渐减慢，22 ℃是青梅菌母种菌丝生长的最适温度。

表1 温度对青梅菌母种菌丝生长的影响（菌丝日均生长速率：mm/d）

图4 青梅菌母种11℃下生长状况

2.3 温度对青梅菌原种菌丝生长的影响

青梅菌原种菌丝在不同温度下的生长情况见表2。由表2 可以看出，青梅菌菌丝日均生长速率在25 ℃最高，在25 ℃以下随着温度升高逐渐加快，在25 ℃以上随着温度升高逐渐减慢，25 ℃是青梅菌原种菌丝的最适生长温度。

表2 温度对青梅菌原种菌丝生长的影响（菌丝日均生长速率：mm/d）

2.4 培养基对青梅菌原种菌丝生长的影响

青梅菌原种在不同培养基中生长状况见表3。由表3 可以看出，青梅菌原种菌丝在棉籽壳培养基中的日均生长速率极显著的高于其他4 种培养基，因此棉籽壳培养基是青梅菌原种菌丝生长的最佳培养基。

表3 培养基对青梅菌原种菌丝生长的影响（菌丝日均生长速率：mm/d）

图5 玉米粒培养基中生长的青梅菌

图6 棉籽壳培养基中生长的青梅菌

3 结论与讨论

对人工分离获得的青梅菌菌丝最适生长温度范围和适宜的培养基配方探究，研究结果表明，青梅菌母种菌丝的最适生长温度为22 ℃，原种菌丝的最适生长温度为25 ℃，最佳培养基配方为棉籽壳培养基，配方为棉籽壳88%、麸皮10%、石灰1%、石膏1%。

Shishikura M.等人在20 ℃培养晶盖粉褶菌的菌丝体[28]，与本文分离的青梅菌母种菌丝最适生长温度接近，他们用晶盖粉褶菌菌丝体接种杜梨的根后在15℃下进行共培养2 个月后获得[29]青梅菌子实体，这和我们采样时土壤温度接近，而与菌丝最适生长温度差别较大，可能的原因是青梅菌菌丝的最适生长温度与子实体形成最适温度不同，或者菌丝在原位生长环境中的生长温度与人工培养条件存在差异，也可能与菌株的特性有关，需要进一步做和植物根的共培养实验。

本实验仅仅对青梅菌菌丝体的生长温度和适宜的培养基进行了探索，作为外生菌根真菌的一员，至少还需要回接到青梅的根部进行共培养，探究其子实体形成的条件，在此基础上才能建立起人工培养的技术体系，这还有很多工作要做。