东方蜜蜂微孢子虫蓖麻毒素B凝集素基因的分子克隆及生物信息学分析

范元婵 王 杰 孙明会 吴 鹰 余岢骏 王心蕊 叶亚萍 钱加珺 张凯遥 王思懿 陈大福，2 郭 睿，2*

(1.福建农林大学 动物科学学院(蜂学学院)，福州 350002；2.福建农林大学 蜂疗研究所，福州 350002)

东方蜜蜂微孢子虫(Nosemaceranae)是一种专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌病原[1]，蜜蜂罹患微孢子虫病可引起蜂群群势和生产力的较大衰减。东方蜜蜂微孢子虫以孢子的形式在蜜蜂个体之间传播，通过摄食经口进入宿主中肠，在特殊的理化环境刺激下以“极丝弹射”将具有感染性的孢原质注入上皮细胞，然后利用宿主细胞的物质和能量满足增殖所需[1-3]。东方蜜蜂微孢子虫感染能使蜜蜂宿主的糖消耗量增加、寿命缩短、免疫基因抑制、细胞凋亡抑制、采集积极性下降以及采集日龄提前[4-5]。目前，由于微孢子虫的转基因操作技术体系尚未建立，绝大多数微孢子虫的基因功能研究滞后。高通量测序技术为微孢子虫的相关研究提供了有力工具。前人对东方蜜蜂微孢子虫进行了一些转录组研究，例如Huang等[6]曾对东方蜜蜂微孢子虫侵染的西方蜜蜂工蜂中肠进行转录组测序和分析，发现病原在宿主细胞中的增殖受到抑制，且己糖激酶、ABC转运体和蓖麻毒素B凝集素(Ricin B-lectin)等毒力因子的基因表达水平下调；Rodríguez等[7]将极管蛋白3编码基因的dsRNA饲喂西方蜜蜂工蜂，结果表明宿主中肠内的孢子载量显著降低，宿主的天然免疫力提升，其生理性能改善，寿命增加；Paldi等[8]通过饲喂西方蜜蜂与东方蜜蜂微孢子虫同源的ATP/ADP转移酶基因的dsRNA，可以有效抑制中肠中东方蜜蜂微孢子虫的数量，降低蜜蜂对低浓度糖水的敏感度，这一过程可能仅由病原介导也可能是宿主体内有与病原相同的RNA沉默系统。本研究前期对东方蜜蜂微孢子虫进行了较系统的组学研究，首次鉴定到204条环状RNA(Circular RNA, circRNA)[9]和83条长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)[10]，并深入解析了东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica，简称意蜂)工蜂的分子机制[11-13]。蓖麻毒素是一种异源二聚体蛋白，属于Ⅱ型核糖体失活蛋白家族，其相对分子质量约为65 ku，由A(RTA)和B(RBL)两条链组成，两条链以链间二硫键(S-S)相连接[14]。凝集素是识别聚糖配体的蛋白质，其作为众多病原的毒力因子，具有介导细胞黏附，可通过干扰细胞膜氧化还原条件协助病原侵染宿主[15]。RBL蛋白通过与细胞表面的糖蛋白结合介导A链进入细胞发挥毒力作用。在家蚕微孢子虫(N.bombycis)中已鉴定出21个RBL蛋白编码基因，它们以串联形式分布在基因组[14]。Liu等[15]研究发现RBL蛋白可增加家蚕微孢子虫在侵染家蚕(Bombyxmori)卵巢细胞(BmN)时的粘附性。蜜蜂微孢子虫(N.apis)是东方蜜蜂微孢子虫的姐妹种，其基因组仅含有1个RBL基因[16]。RBL蛋白具有多个半乳结合位点功能域，能够与细胞表面的多糖蛋白及糖脂中的半乳糖残基结合从而介导RTA进入细胞，故具有凝集素作用[17]。东方蜜蜂微孢子虫基因组包含9个RBL基因[18]，但缺乏深入的研究。本研究前期利用基于链特异性cDNA建库的RNA-seq技术对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子进行深度测序，并基于高质量的组学数据分析筛选出东方蜜蜂微孢子虫NCRBL-081基因。在此基础上，本研究拟首先对NCRBL-081基因的进行分子克隆，再预测NCRBL-081基因的开放阅读框(ORF)及编码的氨基酸序列，并预测NCRBL-081蛋白的信号肽、磷酸化位点和二级结构，进而对东方蜜蜂微孢子虫与其他3种微孢子虫的RBL蛋白进行系统进化分析，以期解决NCRBL-081基因研究不够深入的问题，并为NCRBL-081基因及其编码蛋白的功能研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子由福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)蜜蜂保护实验室制备[19-20]。

1.2 东方蜜蜂微孢子虫的RBL基因来源

本研究前期已利用Illumina测序技术对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子样品进行测序[12]，基于测序所得高质量的转录组数据筛选出9条RBL基因，其中AAJ76_100008081(命名为：NCRBL-081)在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的表达量持续上调[12]，表明了该基因在病原侵染过程中的潜在重要性。因此，本研究选择NCRBL-081进行分子克隆及相关生物信息学分析。

1.3 RBL基因的分子克隆与Sanger测序

利用DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司，中国)提取东方蜜蜂微孢子虫孢子的基因组DNA，作为模板进行PCR扩增。PCR体系包括：模板1 μL，PCR mix 10 μL，上下游引物各1 μL，无菌水7 μL。PCR程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR产物经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像仪(上海培清，中国)下进行观察并对目的片段进行切胶。采用胶回收试剂盒(Vazyme公司，中国)回收目的片段，然后连接到pMD19-T载体(TaKaRa公司，中国)，反应体系包括：pMD19-T载体 1 μL，目的片段10 μL，solution 5 μL，无菌水4 μL。在16 ℃金属浴中进行连接反应2 h。将连接产物转化DH5α感受态细胞，并在含氨苄青霉素的LB固体培养基上进行涂板，然后放入37 ℃生化培养箱培养过夜，用无菌的牙签挑取单菌落放入含氨苄青霉素的LB液体培养基，37 ℃震荡培养12 h，最后取1 mL放入无菌的EP管送至生工生物工程(上海)公司进行双端测序，采用M13引物。

1.4 RBL基因的生物信息学分析

根据NCRBL-081的核酸序列，利用NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)上的ORF工具预测NCRBL-081编码的氨基酸序列。再根据蛋白质的氨基酸序列，利用ExPASy网站(https:∥web.expasy.org/protparam/)上的Protparam、ProtScale、HMMTOP、SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、SOPMA和SWISS-model等软件预测NCRBL-081编码蛋白的理化性质、跨膜结构域、信号肽、磷酸化位点、二级和三级结构模型。

1.5 4种微孢子虫RBL蛋白的系统进化树构建及分析

从NCBI数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中查询和下载东方蜜蜂微孢子虫所有RBL蛋白的氨基酸序列，以及家蚕微孢子虫、蜜蜂微孢子虫和兔脑炎微孢子虫(Encephalitozooncuniculi)的RBL蛋白的氨基酸序列。通过Clustalx软件[21]将上述4种微孢子虫的RBL蛋白的氨基酸序列进行多重比对。再利用MEGA-X软件[22]构建和分析微孢子虫的RBL蛋白系统进化树，使用软件默认参数。

2 结果与分析

2.1 NCRBL-081的分子克隆

PCR扩增产物的电泳结果显示，扩增片段大小(约700 bp)符合预期(图1)。Sanger测序结果显示克隆出的NCRBL-081的核酸序列与转录组测序结果中该基因的核酸序列一致性为100%，说明成功克隆到东方蜜蜂微孢子虫的NCRBL-081基因。

1: NCRBL-081; 2: 无菌水 (阴性对照); M: DNA标准分子量标记。1: NCRBL-081; 2: Sterile water (negative control); M: DNA marker.图1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis for PCR amplification products

2.2 NCRBL-081编码蛋白的预测和分析

NCRBL-081共含有630个核苷酸，可编码209个氨基酸，氨基酸序列为MLIFFRVISKMLILFLFSAIYSEELQFLVKGFGMYICTKDGYTLYGCSDKSYISKFLLEYDNNGKLFIISPKYNKIFDIANNESLILWPKHGGPNQVFELNWINNKEFMLMNREKCVVYNDVTNKFDYKDCKLGSERNKLFKVGPDEERPEQLTRPSLISPTHDNEHAEDDSCSCFDEPIRRKRRHRHHIDDPHYRRRGGHRHYRPMKR。该编码蛋白的分子式为C1123H1700N312O312S12，相对分子质量约为25 ku，等电点为8.93，亲水性为-0.682。此外，该编码蛋白为亲水性蛋白。

NCRBL-081编码蛋白中含有1个典型的信号肽，说明其为分泌型蛋白(图2(a))。磷酸化位点预测结果显示，NCRBL-081编码蛋白还包含9个丝氨酸磷酸化位点、6个酪氨酸磷酸化位点和1个苏氨酸磷酸化位点(图2(b))。二级结构预测结果显示该编码蛋白含有20.10%的α螺旋，8.61%的β折叠，25.84%的延伸链及45.45%的无规卷曲，在11-29个氨基酸的位置有1个跨膜结构域(图2(c))。该编码蛋白的三维结构表现出外显β-1,3-半乳聚糖酶1,3Gal43A的晶体结构，是Ⅱ型核糖体失活蛋白家族的典型特征(图2(d))。

(c)蓝: α螺旋; 红: 延伸链; 绿: β折叠; 紫: 无规则卷曲。(c) blue: α helix; red: extended chain; green: β corner; purple: irregular curl.图2 NCRBL-081编码蛋白的信号肽(a)、磷酸化位点(b)、二级结构(c)和三级结构(d)Fig.2 Signal peptide (a), phosphorylation site (b), secondary structure (c) and tertiary structure (d) of NCRBL-081 encoding protein

2.3 4种微孢子虫RBL蛋白的系统进化树

如表1所示，东方蜜蜂微孢子虫基因组含有9个RBL基因，而蜜蜂微孢子虫仅含有1个RBL基因[23]，家蚕微孢子虫[24]和兔脑炎微孢子虫[25]分别含有16和4个RBL基因。将上述4种微孢子虫的RBL基因编码蛋白进行多重比对，系统进化分析结果显示同一个微孢子虫物种的不同RBL蛋白进化距离较近，而不同微孢子虫物种RBL蛋白进化距离较远；此外，AAJ76_100008081与NCER_100581聚为一支，表现出较近的亲缘关系(图3)。

各分支上的数字为自举值(1 000次重复抽样检验)。Numerals on each node represent bootstrap values from 1 000 replicates.图3 4种微孢子虫的RBL蛋白的系统进化树Fig.3 The phylogenetic tree of RBL proteins of four microsporidian species

表1 4种微孢子虫的蓖麻毒素B凝集素编码基因Table 1 Ricin B-lectin encoding genes in four microsporidian species

3 讨论与结论

微孢子虫仅在宿主细胞内增殖，在体外以休眠态的孢子形式存在[1]。东方蜜蜂微孢子虫专性寄生成年蜜蜂中肠上皮细胞，但迄今尚没有来源于蜜蜂组织或器官的体外传代培养细胞系供东方蜜蜂微孢子虫侵染，因而无法在细胞水平对东方蜜蜂微孢子虫进行转基因操作。2009年，Cornman等[26]测序并公布了东方蜜蜂微孢子虫的基因组。Huang等[27]曾利用small RNA-seq技术探究了东方蜜蜂微孢子虫感染1～6 d的西方蜜蜂工蜂的微小RNA(MicroRNA, miRNA)应答，发现宿主差异表达miRNA(Differentially expressed miRNA, DEmiRNA)可能通过调控物质代谢和能量代谢相关基因表达进行侵染应答。Dussaubat等[28]对受东方蜜蜂微孢子虫胁迫的西方蜜蜂工蜂中肠转录组分析发现病原侵染抑制了参与肠道组织内稳态和更新的通路及基因，推测这是导致蜜蜂宿主在侵染早期死亡的原因之一。

蓖麻毒素是一种细胞毒素蛋白，包含A链和B链，其中A链具有细胞毒素的作用，可导致核糖体失活；而B链属于凝集素，能与细胞膜表面半乳糖受体结合进而协助A链进入细胞[29]。人们已在很多物种中鉴定到与蓖麻毒素B链结构相近的蛋白，这类蛋白统称为RBL蛋白家族[30-31]。此前，东方蜜蜂微孢子虫蓖麻毒素基因虽有少量报道，但都是基于生物信息学方法的预测结果，缺少更深入的研究。在前期研究基础上，本研究通过PCR对东方蜜蜂微孢子虫的的NCRBL-081基因进行扩增，Sanger测序结果证实克隆出的序列确为NCRBL-081基因。这为进一步开展NCRBL-081基因的功能研究提供了必要基础。另外，上述结果也说明基于Illumina HiSeq平台得到的转录组测序数据具有较高的准确性，可作为基因克隆的重要资源，这与前人的研究报道一致[33-35]。李能章[14]曾对家蚕微孢子虫的21个RBL基因进行鉴定和分析，发现多数RBL基因主要以串联形式分布在第6号和463号Scaffold上，其中9个RBL基因的N端含有真核生物典型的信号肽[2]，但只有2个RBL蛋白含有跨膜结构域。Liu等[15]研究发现RBL蛋白能够增强家蚕微孢子虫对BmN细胞的粘附性。东方蜜蜂微孢子虫孢子经极丝弹射将具有感染性的孢原质注入宿主细胞，随后进入增殖周期，利用宿主的物质和能量进行增殖，孢子的数量逐渐增多，最终导致宿主细胞破裂，释放出大量的成熟孢子，进而侵染周围的正常细胞，或随食物残渣排出体外，继续感染同一蜂群的其他蜜蜂个体或临近的其他蜂群[1]。本研究发现NCRBL-081编码蛋白在11～29个氨基酸的位置区域有1个跨膜结构域，同时1～21个氨基酸为1个信号肽。鉴于在翻译过程中蛋白质的信号肽通常会切割掉，推测NCRBL-081编码蛋白并不是膜蛋白，但该编码蛋白在宿主细胞中合成后被分泌到胞外，协助成熟孢子粘附和侵染其他细胞。

在自然环境中，东方蜜蜂微孢子虫的毒力比蜜蜂微孢子虫更强，导致后者逐渐被前者取代[4]。本研究中，通过查询和比较发现蜜蜂微孢子虫仅含有1个RBL基因，而东方蜜蜂微孢子虫含有9个RBL基因，更多的RBL基因或许是东方蜜蜂微孢子虫具有更强毒力的原因之一。系统进化分析结果显示东方蜜蜂微孢子虫的AAJ76_100008081与NCER_100581聚为一支，推测在长期进化过程中该基因发生了复制，东方蜜蜂微孢子虫侵染蜜蜂宿主的意义值得进一步研究。

综上，本研究成功克隆了东方蜜蜂微孢子虫的NCRBL-081基因，并对该基因的编码蛋白进行了生物信息学分析，研究结果揭示了NCRBL-081蛋白的分子特征，并为深入开展NCRBL-081基因及其编码蛋白的功能研究打下了基础。